Summary
采用高效、少量外周血、低剂量 IL-2 的方法, 建立了 CAEBV 患者的 NK 和 T 细胞克隆的简便算法。
Abstract
从淋巴瘤或淋巴综合征患者中, 我们已经描述了一些方法来建立 NK/T 细胞系。这些方法使用饲养细胞, 纯化 NK 或 T 细胞多达10毫升的血液, 或高剂量的 IL-2。本研究提出了一种通过添加重组人 IL-2 (rhIL-2), 通过培养外周血单个核细胞 (PBMC) 来建立 NK 和 T 细胞系的新方法, 并使用2毫升的全血。细胞可以在两周内迅速增殖并维持3月以上。用该方法建立了 7 NK 或 T 细胞系, 成功率高。该方法简便、可靠, 适用于多例 CAEBV 或 NK/T 细胞淋巴瘤细胞株的建立。
Introduction
eb 病毒是无处不在的, 不仅感染了 B 细胞, 而且传染了 T 和自然杀手 (nk) 细胞, 这导致了一些 eb 病相关的 NK/T 淋巴疾病 (LPD) 和淋巴瘤/白血病, 如 eb 联合噬血细胞lymphohistiocytosis, hydroa vacciniforme 淋巴瘤, 淋巴结外 nk/T 细胞淋巴瘤, 鼻型和侵袭性 NK 细胞白血病 1, 2, 3.其中包括严重的慢性主动 eb 病毒 (SCAEBV) 疾病, 主要发生在东亚, 现在被认为是由 eb 病毒感染的 T 或 NK 细胞的克隆扩张引起的 LPD4,5,6,7, 但没有明显的免疫缺陷存在于传染性传染性 (IM) 类似的症状, 包括发烧, 肿大, 淋巴结肿大, 肝功能障碍持续或反复, 以及高 eb 病毒-DNA 负荷在外围血液8,9。CAEBV 患者预后不佳10,11, 其发病机制和 eb 病毒的作用尚不清楚。因此, 从 eb 病毒相关的 nk/t 淋巴疾病和淋巴瘤的细胞系是非常有用的细胞模型, 以澄清 eb 病毒诱发 NK 或 t 细胞增殖机制及其与高发病率的白血病或淋巴.
到目前为止, 已经用不同的技术建立了几个单元格线12,13,14,15,16。人类 nk 细胞系由 nk 细胞淋巴瘤/白血病建立, 通过与小鼠基质细胞系进行共培养, 并在 rhIL-2 的浓度为每毫升15。KAI3 是由患有严重蚊子过敏或 SCAEBV 的患者与自体永生细胞系 (拼箱)、乙肝病毒转化的 B 细胞、作为饲养细胞以及在 100 u/毫升16中添加 rhIL-2 的病人建立的另一种 NK 细胞系。SNK6 和 SNT8 通过添加大剂量的 rhIL-2 (700 u/毫升)12, 从鼻 NK/T 细胞淋巴瘤患者的肿瘤组织中获得。与类似的技术, SNK-1 细胞是从 CAEBV 患者, 培养从 PBMC 通过去除 T 细胞和添加 700 u/毫升 rhIL-213,17。SNT13 和 SNT15 是通过删除 CD4+ 和 CD8+ 单元格18建立的。到目前为止, 其他 t 细胞和 nk 细胞系从 eb 病毒-NK/T LPD 患者都开发了此方法19。
上述现有方法的弊端包括: 饲养细胞的使用、高剂量 IL-2 的要求、多达10毫升全血的利用率, 或对 NK/T 细胞的净化, 这在临床上是非常有挑战性的, 因为在开始培养之前, 必须验证 eb 病毒潜伏感染的细胞类型。由于 CAEBV 主要发生在亚洲儿童身上, 所以在所有地区都不容易获得10毫升血液。在本研究中, 我们开发了一种新的简单的方法, 成功率高, 建立 NK 和/或 T 细胞系, 通过培养 PBMC 从 CAEBV 患者使用低剂量的 rhIL2 和2毫升的全血容量, 没有喂食细胞。结果表明, 该方法效率高, 节省时间。
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Protocol
这项研究获得中国科学院遗传学与发展生物学研究所伦理委员会的批准, 该议定书遵循人类福利的机构指南。
注意: 有关工作流的示意图, 请参见图 1 。
1. CAEBV 患者 PBMC 的分离
- 根据制造商的指示, 通过梯度 (例如, Ficoll 菌斑) 离心法从 CAEBV 患者的2毫升全血中纯化原 PBMC。或者, 用 RPMI 1640 培养基从液氮中解冻冷冻 PBMC。
- 增加2µL 的台盼蓝 (0.4%) 到18µL 细胞悬浮, 等待3分钟染色细胞, 转移悬浮到细胞计数器板, 并测量细胞的浓度和活力与自动细胞计数器。
- 准备细胞悬浮在密度 2-3×106细胞/毫升补充与完整的 RPMI 1640 培养基含有20% 人血清 (热灭活在56°c), 2 毫米 l-谷氨酰胺, 和抗生素 (100 µg/毫升链霉素, 100 U/毫升青霉素)。种子1毫升 PBMC 悬浮每井入24井细胞培养板材。
- 每井加 150 U rhIL-2。
- 将文化板块放置在 5% CO2孵化器中37摄氏度。
- 2天, 观察显微镜下的细胞形态学 (200X 倍放大);细胞在明亮和圆的时候处于良好的状态。
2. 细胞的扩张和可存活细胞的编号
- 观察细胞形态学在显微镜下 (200X 放大), 并监测细胞生长的条件, 通过编号的细胞改变培养基: 增加2µL 的台盼蓝 (0.4%) 到18µL 细胞悬浮, 并计算细胞的浓度 (见 1.2, 图 2)。
- 在24井板中丢弃500µL 的培养基, 并添加500µL 新鲜完整的培养基。每井加 150U rhIL-2。
- 按照步骤 2.2, 每周更改两次媒体。
- 绘制单元格增长曲线 (图 3)。
- 当存活细胞浓度超过 5×106/毫升时, 在每个井中, 将细胞分成 1-2×106细胞/ml 浓度的新井。这个过程需要2-4 周时间。
3. 细胞分型流式细胞术
- 当单元格展开时, 收集 1×106单元格以确定单元格线的表型。240 x g的离心细胞在室温下为5分钟 (NK/T 细胞将沉淀在管的底部)。
- 放弃上清, 通过添加7毫升 PBS 洗涤沉淀。在室温下, 离心机在 240 x g处为5分钟。重复一次。
- 在每管中加入200µL 人血清, 混合均匀, 在室温下孵育10分钟。
- 在室温下, 离心细胞在 240 x g 处为5分钟。丢弃上清, 然后在 1×106/mL 上用冷 PBSA (PBS + 0.2%BSA) 重新挂起单元格。将单元格分成5管, 每个管包含 2×105单元格。
- 离心细胞在 240 x g 5 分钟在4摄氏度。丢弃上清, 再用含有10µL PE (或 PE-Cy7) 和10µL FITC 的 PBSA 缓冲或 PBSA 的细胞重新挂上标记的抗体, 如图 4所示, 将 T 或 NK 细胞的细胞受体染色。使用 PBSA 缓冲区暂停的单元格用作负控制。
- 在黑暗中用20-30 分钟的冰块在冰上孵化细胞。
- 用冷 PBSA 洗两次细胞, 用300µL 冷 PBSA 重新悬浮细胞。
- 用流式细胞仪分析红细胞表型。
- 在 "创建工作表" 条件下设置流式细胞仪。使用显示正散射 (FSC) 与侧面散射 (SSC) 的点图建立实验模板。
- 负载同种控制管, 以优化 fsc 和 SSC 电压, 并优化 fsc 阈值, 以消除碎片, 而不干扰细胞群体的利益。删除所有参数, 除 FSC, SSC, FITC, PE 和 PE-Cy7。
- 使用同种控件和每个2色分析组中的单个正则控件执行补偿。
- 加载样本和创建 HLA-DR vs CD19, CD4 vs CD8, CD56 vs CD16 和 CD3 VS CD16 点地块显示不同的细胞数量。
注: PBMC 用于使用负/同种控制和单阳性控制进行补偿。采用流式细胞仪对2色免疫荧光进行了常规的表面标记表达分析。以下抗体包括: 抗 HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 共轭异硫氰酸荧光素 (FITC), anti-CD8, anti-CD56, CD3 与藻红蛋白 (PE) 共轭, anti-CD19 与 PE-Cy7 共轭。
4. NK/T 细胞的扩展和冷冻保存
- 当细胞表型分析完成时, 改变培养基。小心地取出一半的上清, 避免接触盘子底部的细胞。添加相同数量的新鲜培养基中含有300毫升 rhIL-2 的细胞板。
- 每3天改变一半的培养基 (2.2), 直到细胞簇在显微镜下清晰可见 (图 2)。通常, 此过程需要2-3 周时间。
- 在混合同一血统的不同水井后, 将细胞从24孔板转移到 T25 培养瓶中。当培养基的体积扩大到10-15 毫升时, 将培养基的体积加倍, 使其变黄。添加 rhIL-2 的浓度为 150 U/毫升。
- 改变培养基24小时后冷冻后2-3 周生长, 当细胞质量可以观察肉眼。用细胞计数器测量细胞浓度。
- 离心细胞悬浮5分钟在 240 x g, 并重新悬浮细胞颗粒在密度为 5-10 x 106细胞/毫升与冷冻库存解决方案, 其中含有90% 胎牛血清和 10% dimethylsulfoxide (亚砜)。以每分钟1摄氏度的速率冻结至-80 摄氏度, 然后直接转入液氮。
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Representative Results
在建立细胞系3天后, 多态细胞开始出现 (图 2)。7天后, 细胞生长迅速, 因为细胞的数量和生存能力都以较高的速率增加 (图 3)。当细胞浓度可超过 3-6 x 106时, 10-14 天后, 小簇细胞明显可见。在这一时期, 细胞应该被分成两到三口的培养板。大约一个月后, 一旦单元格号达到 3-5×107, 计数就足够高, 可以保存。
另一个重要的问题是在细胞培养成功的时候确定表型。我们的研究结果表明, T (L196) 和 NK (M296) 细胞可以通过上述方法 (图 4) 进行培养, 并且可以用这种技术建立细胞系, 因为细胞在良好的条件下生长了3月以上。
图 1: 工作流的示意图表示形式.第一天, 从 CAEBV 患者中采集抗凝血, PBMC 分离培养, 1640 种培养基含有20% 人血清和150毫升 rhIL-2。在 5% CO2的存在下, NK/T 细胞生长在37摄氏度。经过2-4 周的培养, 细胞开始快速生长。当浓度超过 5 x 106 /毫升时, 我们将细胞分成2-3 口, 浓度为 2×106。在2-3 周的时间里, 细胞在显微镜下明显可见, 从24井板块转移到 T25 瓶中。当细胞质量可以用肉眼观察时, Cryopreserve 细胞。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 培养过程中的细胞形态学变化.细胞的培养和观察, 在指定的天数。多态细胞 (箭头指出) 在显微镜下清晰可见3-7 天后, 细胞开始快速生长后7-14 天的文化。光镜的原始放大倍数为200X。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 细胞增殖的生长曲线.经过7天的培养, 细胞开始快速增长(A)和高生存能力(B)。细胞的浓度和生存能力由一个自动化的细胞计数器测量, 其步骤如下: 增加2µL 的台盼蓝 (0.4%) 到18µL 细胞悬浮液染色, 等待3分钟, 转移悬浮到细胞计数器板, 并测量细胞的浓度和细胞活力与自动细胞计数器。误差线是三个副本的标准偏差。L196, Z290, M296, L311 是四细胞线的名字。测量生长曲线的起始浓度约为 3 x 106。请单击此处查看此图的较大版本.
图 4: L196 和 M296 细胞系流式细胞术分析的典型浇注策略.PBMC 用于调节 FSC 和 SSC 电压。在 FSC 和 SSC 地块中, P1 的活细胞和单淋巴细胞群被封闭。同种控制和单阳性控制用于进行补偿。采用四对2色免疫荧光共轭抗体染色法对表面标记物的表达进行分析。抗 HLA-DR 和 anti-CD19 用于检测 B 细胞, 而 anti-CD3、anti-CD4 和 anti-CD8 用于检测 T 细胞。Anti-CD16 和 anti-CD56 被用来定义 NK 细胞。(A) L196 的表型为 CD19-HLA-DR+CD16-CD56+CD3+CD4+CD8+, 主要细胞类型为 CD8+。(B) M296 为 CD19-HLA-DR+CD16+CD56+CD3-CD4-CD8+, 主单元格类型为 CD16+CD56+。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在该协议中, 建立了 CAEBV 患者全血 NK/T 细胞系的新方法。与现有方法相比, 该方法的主要优点是其简单性和对少量血液的要求, 同时具有较高的成功率和良好的细胞生存条件。此外, 可以通过培养 PBMC 来建立 NK/T 细胞系, 而不确定 eb 病毒潜伏预先感染的细胞类型, 因为这种测定在培养前会消耗更多的血液和时间。另外, 细胞系可以通过细胞系建立后的流式细胞术进行分析, 从而纯化细胞的不同表型。此外, 该方法使用低剂量的 rhIL-2, 不需要馈线细胞。利用这种方法, 我们从 8 CAEBV 患者中开发出7细胞株, 并在一个月内将其冷冻保存。尚未发展成细胞系的人可以在不扩散的情况下存活5月以上, 这背后的原因需要进一步探索。
需要注意的是, 细胞生长严格依赖于重组人 IL-2 的存在, 这与以前的报告20,21一致;没有人类的 IL-2 细胞会在3周内死亡显然, 高品质的 IL-2 是细胞增殖必不可少的, 虽然决定细胞增殖能力的因素体外仍然需要澄清。IL-2 所需剂量在不同细胞系之间是可变的, 例如, 50 的 u/毫升对维持 M296 的增殖是令人满意的。然而, 在研究中没有提出最经济、最可靠的建立 NK/T 细胞系的浓度;事实上, 150 的 U/毫升是足够的成功。
在细胞培养过程中, 影响细胞生长的因素, 主要 PBMC 的生存能力是最重要的。为了确保成功, PBMC 应该尽可能的新鲜。毫无疑问, 细胞浓度是影响成功培养的重要因素, 因此阈值不应低于每毫升 105 。如果从样本中分离的总细胞数小于 106, 则使用微型井电池板保持足够的细胞浓度是初始培养中的一种替代选择。此外, 在使用溶血反应来丰富 PBMC 的情况下, 在我们以前报告的22中, NK 和 T 细胞系可以建立, 甚至有一定数量的外周血。如《议定书》所述, 人血清是文化开始时细胞存活的另一个关键因素。我们推测, 血清中存在的一些未知成分存在或不同的胎牛血清, 是必要的 T/NK 细胞增殖。
该方法有两个限制。首先, 关于此方法有几个未回答的问题, 例如 eb 病毒如何和为什么感染 nk 或 t 细胞在体内, nk/t 细胞生长和增殖的机制体外, 以及哪些类型的细胞可以建立成细胞系在一个病人。虽然我们无法控制的细胞类型和纯度, 这是不确定的方法, 这些因素可能取决于细胞 eb 病毒感染的病人。通过该协议, NK 和 T 细胞可以建立成细胞系, 但这种方法不能优先培养一种类型。然而, 有一个主要的群体的这些细胞。第二, 有报告说, 有 LPD 或 nk/t 淋巴瘤患者的 NK 和 t 细胞克隆可以建立到细胞系, 而另一些则可以维持几个月的17。目前研究中获得的细胞可以在3月内增殖, 但是它们是否能无限期地扩散需要验证。
总之, 使用这种方法, CAEBV 或 NK/T 淋巴瘤的细胞线可以很容易地获得有限的血液和低剂量的 IL-2 没有饲养细胞。这些细胞系将有助于研究 NK/T 细胞 eb 病毒的持久性和 eb 病毒相关白血病或淋巴瘤的发病机制。
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Disclosures
D.Z.、X.Z. 和 X.C. 是在等待专利申请方面的共同发明者, 涵盖了此方法用于建立 NK/T 细胞系的潜在用途以及本研究建立的细胞系。D.Z.、X.Z. 和 X.C. 宣布在这项工作中没有竞争的财政利益。其余的作者宣布, 他们没有竞争的金融利益。
Acknowledgments
这项工作得到了中国科学院重点项目 (KFZD-SW-205)、中国科学院战略生物资源技术支持系统 (CZBZX-1 和 ZSSB-004) 的支持, 并获得中国国家科学基金会资助 (81401640) 和上海自然科学基金 (14ZR1434800)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hu HLA-DR FITC | BD | 560944 | antibody for FACS |
| Hu CD4 FITC | BD | 555346 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD8 PE | BD | 557086 | antibody for FACS |
| Hu CD3 PE | BD | 555340 | antibody for FACS |
| Hu CD16 FITC 3G8 | BD | 555406 | antibody for FACS |
| Hu/NHP CD56 PE MY31 | BD | 556647 | antibody for FACS |
| hu/CD19 PE-Cy7 | BD | 560728 | antibody for FACS |
| human IL-2 | Roche | 11147528001 | |
| human serum | MRC | CCC118-125 | |
| CO2 incubator | SANYO | ||
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| microscope | OLYMPUS CKX53 | CKX53 | |
| Automated Cell Counter | Countstar | IC 1000 | For cell counting |
| 24 well cell culture cluster | Corning Incorporated | 3524 | Polystyrene plates |
| 25cm2 cell culture flask | Nest | 707001 | Polystyrene |
| FBS | Gibco | 10270 | Component of cell medium |
| RPMI Medium 1640 | life | 22400089 | For cell medium |
| L-Glutamine | Amresco | 374 | Component of cell medium |
| 100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | Component of cell medium |
| Ficoll paque plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | For in vitro isolation of lymphocyte |
| DMSO | Sigma | D2650 | For freezing cells |
| flow cytometer | BD | BD FACSAria II | |
| soft ware | BD | BD FACSDiva soft ware | FACS analysis |
References
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