JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

NK ve kronik aktif Epstein - Barr virüsü enfeksiyonu olan hastalarda T hücre satırlarından kurmak için etkili ve basit bir yöntem

Published: March 30, 2018
doi:
10.3791/56515
, , , , , ,
1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital,Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology,Chinese Academy of Sciences

Summary

NK ve T Hücre klonlar CAEBV hastalardan elde etmek için basit bir yöntem yüksek verimlilik, periferik kan küçük bir miktar ve düşük doz IL-2 ile geliştirilmiştir.

Abstract

Birkaç yöntem NK/T Hücre Lenfomasi veya lenfoproliferatif sendromu olan hastalar satırlarından kurmak için tarif edilmiştir. Bu yöntemler besleyici hücreler, 10 mL kan olduğu kadar arıtılmış NK veya T hücreleri veya yüksek doz IL-2. Bu çalışmada periferik kültür tarafından NK ve T hücre hatları mononükleer hücreler (PBMC) kan rekombinant insan IL-2 (rhIL-2) eklenmesi ile kurmak için güçlü ve basit bir strateji ile yeni bir yöntem sunar ve tam kan 2 mL kadar az kullanır. Hücreleri hızlı bir şekilde iki hafta içinde çoğalırlar ve 3 aydan fazla muhafaza. Bu yöntemle, 7 NK veya T hücre hatları yüksek başarı oranı ile kurulmuştur. Bu yöntem basit, güvenilir ve hücre hatları CAEBV veya NK/T Hücre Lenfomasi olan durum daha kurulması için geçerli.

Introduction

Epstein – Barr virüsü (EBV) her yerde birden bulunan ve sadece B hücreleri, ama aynı zamanda T ve doğal öldürücü (NK) hücreleri, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar (LPD) ve lenfoma/lösemi, EBV ilişkili Hemofagositik gibi bir dizi neden bozar hücre lösemi1,2,3Lenfohistiyositozis, hydroa vacciniforme benzeri lenfoma, Ekstranodal NK/T hücreli lenfoma, burun türü ve saldırgan NK. Bunlar arasında özellikle Doğu Asya’da olay olduğu ve hangi şimdi EBV-enfekte T veya NK hücreleri4,5,6, klonal genişleme neden bir LPD olarak kabul edilir şiddetli kronik aktif EBV (SCAEBV), bir hastalıktır 7, ama belirgin immün yetmezlik olmadan mevcut Enfeksiyöz Mononükleoz (IM)-ısrarla veya yerleştirilmiştir ateş, hepatosplenomegali, lenfadenopati ve karaciğer fonksiyon bozukluğu gibi belirtiler yanı sıra yüksek EBV-DNA yüklemek gibi periferik kan8,9. CAEBV olan hastalarda bir kötü prognoz10,11ve onun Patogenez ve EBV rol belirsizdir. Bu nedenle, EBV ilişkili NK/T lenfoproliferatif hastalıklar elde edilen satırları hücre ve EBV mekanizmasının açıklığa kavuşturulması NK veya T hücre çoğalması ve ilişkisini indüklenen yüksek insidansı lösemi için lenfomalarin bazilarinin hücre modelleri çok yararlı veya Lenfoma.

Bugüne kadar birçok hücre satır farklı teknikler12,13,14,15,16ile kurulmuştur. Bir insan NK hücre kültürünü, NK-YS, NK hücre Lenfoma/lösemi, bir fare stromal hücre satırıyla besleyici olarak ve rhIL-2 mL15başına 20U bir konsantrasyon, huzurunda ortak kültürü çalışmalarının tarafından kurulmuştur. KAI3 oldu hasta şiddetli sivrisinek anti ile veya SCAEBV ile Otolog lymphoblastoid hücre kültürünü (LCL), kurulan başka bir NK hücre kültürünü B hücreleri EBV, besleyici hücreler ve rhIL-2 100U/mL16ek olarak değiştirdi. SNK6 ve SNT8 burun NK/T Hücre Lenfomasi hastalar tümör dokulardan yüksek doz rhIL-2 (700U/mL)12ekleyerek elde edilmiştir. Benzer tekniği ile SNK-1 T hücreleri kaldırıp 700U/mL rhIL-213,17ekleyerek PBMC kültürlü CAEBV hastalardan hücresiydi. SNT13 ve SNT15 CD4 + ve CD8 + hücreleri18çıkarma tarafından kurulmuştur. Şimdiye kadar diğer T hücre ve NK hücre hatları EBV-NK/T LPD hastaların tüm bu yöntemi19ile geliştirilmiştir.

Yukarıda belirtilen varolan yöntemleri dezavantajları besleyici hücreler, istihdam yüksek doz IL-2, olduğu kadar 10 mL tam kan kullanımı veya arıtma NK/T hücrelerinin şartı vardır nedeniyle klinikte çok zor bulunur hangi tip-in o EBV gizlice hücre doğrulama gerekliliği başlamadan kültürüne bozar. Olarak CAEBV ağırlıklı olarak Asya çocuklarda ortaya çıkar, 10 mL kan tüm bölgelerde elde etmek kolay değil. Bu çalışmada, düşük doz rhIL2 ve 2 mL tam kan hacmi olmayan besleyici hücreler kullanarak CAEBV hastaların PBMC kültür tarafından NK ve/veya T hücre hatları kurmak için yüksek başarı oranı ile yeni basit bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemi sonuçları, yüksek verimlilik ve zaman tasarrufu kanıtlanmıştır.

Protocol

Bu çalışmada genetik Enstitüsü ve gelişim biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi Etik Kurulu tarafından kabul edildi ve protokol insan refahı için kurumsal kuralları izler. Not: Bkz. şekil 1 iş akışı bir şematik için. 1. PBMC CAEBV hastaların izolasyonu Tam kan CAEBV hastaların 2 mL gelen birincil PBMC degrade tarafından (örneğin, Ficoll-plak) arındırmak Santrifüjü üreticinin yönergeleri izley…

Representative Results

3 gün hücre hatları kurulması sırasında kültür sonra çok biçimli hücreler (Şekil 2) görünmesini başlar. Yüksek bir oranda (şekil 3) hücre canlılığı ve numarası arttıkça 7 gün sonra hücreleri hızlı bir şekilde büyümek. Hücre küçük kümeleri 10-14 gün sonra büyüyen, 3-6 × 106hücre konsantrasyonu aştığında açıkça görülebilir. Bu dönemde, hücre kültür plaka iki ya da ü…

Discussion

Bu protokol için tam kan CAEBV hastaların NK/T hücre satırlarından kurmak için yeni bir yöntem geliştirmiş. Yüksek başarı oranı ve iyi koşullarda hücre canlılık sergiler Ise mevcut yöntemleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntemin en büyük avantajı sadeliği ve kan, sadece küçük bir ses onun şartı var. Ayrıca, NK/T hücre hatları hücre tipleri gizlice peşin, enfekte belirlenmesi EBV daha fazla kan ve kültür önce zaman tüketmek belirlenmesi olmadan PBMC kültür tarafından kurula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser anahtar projeleri, Çin Bilimler Akademisi (KFZD-Batı-205), stratejik biyolojik kaynakların teknoloji destek sistemi, Çin Bilimler Akademisi (CZBZX-1 ve ZSSB-004) ve hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Bilim Vakfı Çin () 81401640) ve Şangay Doğa Bilimleri Fonu (14ZR1434800).

Materials

Hu HLA-DR FITC BD 560944 antibody for FACS
Hu CD4 FITC BD 555346 antibody for FACS
Hu/NHP CD8 PE BD 557086 antibody for FACS
Hu CD3 PE BD 555340 antibody for FACS
Hu CD16 FITC 3G8 BD 555406 antibody for FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31 BD 556647 antibody for FACS
hu/CD19 PE-Cy7 BD 560728 antibody for FACS
human IL-2 Roche 11147528001
human serum MRC CCC118-125
CO2 incubator SANYO
Centrifuge Techcomp CT6T Centrifugation
microscope OLYMPUS CKX53 CKX53
Automated Cell Counter Countstar IC 1000 For cell counting
24 well cell culture cluster Corning Incorporated 3524 Polystyrene plates
25cm2 cell culture flask Nest 707001 Polystyrene
FBS Gibco 10270 Component of cell medium
RPMI Medium 1640 life 22400089 For cell medium
L-Glutamine Amresco 374 Component of cell medium
100 x streptomycin penicillin solution BioRoYeeBRY-2309 BioRoYee BRY-2309 Component of cell medium
Ficoll paque plus GE Healthcare 17-1440-03 For in vitro isolation of lymphocyte
DMSO Sigma D2650 For freezing cells
flow cytometer BD BD FACSAria II
soft ware BD BD FACSDiva soft ware FACS analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, J. I. Epstein-Barr virus infection. N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).
  2. Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008. Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).
  3. Oshimi, K. Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies. Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).
  4. Kawa, K., et al. Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease. Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).
  5. Kimura, H. Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?. Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).
  6. Kimura, H., et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. Blood. 98 (2), 280-286 (2001).
  7. Ohshima, K., et al. Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD. Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).
  8. Okano, M. Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome. Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).
  9. Straus, S. E. The chronic mononucleosis syndrome. J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).
  10. Jones, J. F., et al. T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections. N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).
  11. Kikuta, H., et al. Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease. Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).
  12. Nagata, H., et al. Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus. Blood. 97 (3), 708-713 (2001).
  13. Nagata, H., et al. Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection. Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).
  14. Tabata, N., et al. Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset. J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).
  15. Tsuchiyama, J., et al. Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection. Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).
  16. Tsuge, I., et al. Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line. Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).
  17. Zhang, Y., et al. Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions. Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).
  18. Oyoshi, M. K., et al. Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection. Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).
  19. Imadome, K., et al. Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells. PLoS Pathog. 7 (10), e1002326 (2011).
  20. Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).
  21. Spits, H., Yssel, H. Cloning of Human T and Natural Killer Cells. Methods. 9 (3), 416-421 (1996).
  22. Liu, X., Xu, C., Duan, Z. A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines. J Vis Exp. (119), (2017).
  23. Kawabe, S., et al. Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases. Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).

Tags

NK CellsT CellsEpstein-Barr VirusCAEBVCell Line EstablishmentCell CulturePBMCIL-2Cell ProliferationCell Viability
check_url/56515?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Xu, C., Ai, J., Zhang, Q., Li, T., Wu, X., Xie, Z., Duan, Z. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (133), e56515, doi:10.3791/56515 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image