Uso di zinco sinaptica istochimica per rivelare diverse regioni e lamine nel cervello in via di sviluppo ed adulto
Summary
Descriviamo una procedura istochimica che rivela la caratteristica dello zinco laminare e areal modelli in diverse regioni del cervello di macchiatura. Il modello di macchiatura di zinco può essere utilizzato in combinazione con altri marcatori anatomici per distinguere attendibilmente strati e regioni nel cervello in via di sviluppo e adulto.
Abstract
Caratterizzazione di organizzazione anatomica e funzionale del cervello e sviluppo richiede un’identificazione accurata di circuiti neurali distinti e regioni nel cervello adulto e immaturo. Qui descriviamo una procedura di colorazione istochimica di zinco che rivela differenze nel pattern di colorazione tra diversi strati e regioni del cervello. Altri hanno utilizzato questa procedura non solo per rivelare la distribuzione di zinco-contenendo i neuroni e circuiti nel cervello, ma anche per delineare correttamente areali e laminari confini nel cervello in via di sviluppo e adulto in diverse specie. Qui illustriamo questa procedura con immagini dallo sviluppo di colorazione e furetto adulto cervelli. Abbiamo rivelato un modello di macchiatura di zinco che serve come indicatore anatomico delle aree e livelli e può essere utilizzati in modo affidabile per distinguere le aree corticali visive nella corteccia visiva in via di sviluppo e adulta. L’obiettivo principale del presente protocollo è di presente un metodo istochimico che permette l’identificazione precisa dei livelli e delle regioni nel cervello adulto e in via di sviluppo dove altri metodi non riescono a farlo. Secondariamente, in concomitanza con analisi densitometrica delle immagini, questo metodo permette di valutare la distribuzione di zinco sinaptica per rivelare potenziali modifiche nel corso dello sviluppo. Questo protocollo descrive dettagliatamente i reagenti, strumenti e passaggi necessari per successivamente macchia sezioni di cervello congelato. Anche se questo protocollo è descritto usando il tessuto di cervello di furetto, può essere facilmente adattato per l’uso in roditori, gatti o scimmie così come in altre regioni del cervello.
Introduction
Le macchie istologiche sono state usate tradizionalmente per aiutare nell’identificazione delle aree corticali in varie specie, rivelando le differenze nelle caratteristiche architettoniche. L’uso combinato di tecniche istochimiche come sostanza di Nissl, reattività del citocromo ossidasi (CO) o mielina può rivelarsi fruttuosa, come rivelano i limiti areali simili nel cervello adulto. Tuttavia, queste macchie istochimiche non rivelano sempre adeguatamente chiari confini tra aree corticali e livelli nel cervello immaturo.
Nel sistema nervoso centrale, lo zinco ha diverse funzioni critiche che includono la struttura del DNA, che agisce come cofattore degli enzimi, che partecipano a numerose funzioni di regolamentazione e di agire come un neuromodulatore attraverso la sua presenza in vescicole sinaptiche di stabilizzazione 1. zinco sinaptico è unico in quanto possono essere visualizzato utilizzando i metodi istologici, mentre lo zinco legato alle proteine non può essere visualizzato in quel momento2. Questa caratteristica è stata sfruttata per rivelare il disegno di zinco sinaptica in diverse regioni corticali e l’istochimica zinco sinaptica è stato utilizzato in una serie di studi. Un sottoinsieme di neuroni glutamatergici nella corteccia cerebrale contengono zinco nelle vescicole presinaptiche entro loro assoni terminali3,4. Gli studi istochimici hanno rivelato una distribuzione eterogenea di zinco sinaptica in corteccia cerebrale5,6,7. Ci sembra essere una diversa distribuzione area e laminare di zinco histochemically reattiva in diverse regioni corticali (ad es., visual contro corteccia somatosensory), o strati (ad esempio, i livelli dello zinco nella supragranular e infragranular strati della corteccia visiva primaria sono sostanzialmente superiori a livello di input thalamocortical IV con i livelli relativamente bassi dello zinco sinaptica)5,8,9. L’eterogeneità in zinco sinaptico colorazione osservata nella corteccia è particolarmente vantaggioso, in quanto facilita l’identificazione areal e laminare.
Qui presentiamo una descrizione dettagliata di una procedura di istochimica zinco sinaptica, che è una versione modificata 1982 metodo10 di Danscher. Questo metodo utilizza la selenite iniettata intraperitonealmente (IP) in animali come un agente chelante. La selenite viaggia al cervello di reagire con piscine di zinco liberi trovati in vescicole di un sottoinsieme di glutamatergic sinapsi nel cervello. Questa reazione produce un precipitato che può essere migliorato successivamente di sviluppo d’argento2,10,11.
Questa procedura rivela pattern laminare e areali di zinco sinaptico colorazione; l’analisi densitometrica può essere utilizzato per valutare questi modelli sia qualitativamente che quantitativamente nel cervello adulto e immaturo per studiare gli effetti di altri interventi, come manipolazioni sensoriale, ambientale, farmacologiche o genetiche. Inoltre, uno potrebbe anche voler valutare potenziali cambiamenti inerenti allo sviluppo nella distribuzione di zinco sinaptica in altre strutture corticale o sottocorticale in altri sistemi-modello. Le informazioni quantitative che fornisce analisi densitometrica in questo metodo possono essere vantaggiose per il seguente sviluppo del cervello nel corso del tempo. Questo protocollo fornisce un compagno ad altri marcatori istochimici e immuno – per rivelare i confini laminari e areali.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo studio corrente impiega una tecnica istochimica basata su una versione modificata del Danscher (1982) metodo10, per cui zinco sinaptica localizzazione può essere rilevato e visualizzato nel cervello. Questo metodo funziona essenzialmente iniettando l’animale con il selenito di sodio chelante (Na2SeO3) di zinco (15 mg/kg). A seguito di iniezione, la selenite viaggia al cervello e si lega di zinco liberi che è localizzato alle vescicole presinaptiche di zinco contenente ne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal centro nazionale per le risorse di ricerca (2G12RR03060-26A1); L’Istituto nazionale sulla salute delle minoranze e le disparità di salute (8G12MD007603-27) dal National Institutes of Health; Professional Staff Congress-City University of New York (PSC-CUNY); e facoltà Research Grant (la RFG II) American University of Sharjah. Ringraziamo Vidyasagar Sriramoju per introdurre noi a questi metodi.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
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