Användning av Synaptic zink histokemi att avslöja olika regioner och bladskivan i utvecklingsländer och vuxna hjärnan
Summary
Vi beskriver ett histochemical förfarande som avslöjar karakteristiska laminär och areala zink färgning mönster i olika hjärnregioner. Zink-färgning mönstret kan användas tillsammans med andra anatomiska markörer att tillförlitligt skilja skikt och regioner i utvecklingsländerna och vuxna hjärnan.
Abstract
Karakterisering av anatomiska och funktionella hjärnan organisation och utveckling kräver korrekt identifiering av distinkta neurala kretsar och regioner i hjärnans omogna och vuxen. Här beskriver vi ett zink histochemical färgningsproceduren som avslöjar skillnader i färgning mönster bland olika skikt och regioner i hjärnan. Andra har utnyttjat detta förfarande inte bara avslöja fördelningen av zink-innehållande nervceller och kretsar i hjärnan, men också att framgångsrikt avgränsa areala och laminär gränser i utvecklingsländer och vuxna hjärnan i flera arter. Här vi illustrera detta färgning förfarande med bilder från utvecklingsländer och vuxen iller hjärnor. Vi avslöja ett zink-färgning mönster som fungerar som en anatomisk markör områden och lager, och kan användas på ett tillförlitligt sätt att skilja visuella kortikala områden i utvecklingsländer och vuxen syncentrum. Det huvudsakliga målet med detta protokoll är att presentera en histochemical metod som möjliggör korrekt identifiering av skikt och regioner i utvecklingsländerna och vuxna hjärnan där andra metoder misslyckas att göra detta. I andra hand i samband med Densitometrisk bildanalys gör denna metod att man kan bedöma fördelningen av synaptic zink att avslöja potentiella förändringar i hela utvecklingen. Det här protokollet beskriver i detalj reagenser, verktyg och steg som krävs för att successivt färga frysta hjärnan sektioner. Även om detta protokoll beskrivs med iller hjärnvävnad, kan det enkelt anpassas för användning i gnagare, katt eller apor såväl som i andra regioner i hjärnan.
Introduction
Histologiska fläckar har traditionellt använts till stöd i identifiering av kortikala områden i olika arter genom att avslöja skillnader i arkitektoniska funktioner. Den kombinerade användningen av histochemical metoder såsom för Nissl ämne, cytokrom oxidasnegativ (CO) reaktivitet eller myelin kan visa sig fruktbart som de avslöjar liknande areala gränser i den vuxna hjärnan. Dessa histochemical fläckar avslöjar dock inte alltid tillräckligt tydliga gränser mellan kortikala områden och lager i den omogna hjärnan.
I det centrala nervsystemet har zink flera kritiska funktioner som inkluderar stabilisera DNA-struktur, fungerar som en enzym kofaktor, deltar i många tillsynsuppgifter och agerar som en neuromodulator genom sin närvaro i synaptiska vesikler 1. synaptic zink är unikt eftersom det kan visualiseras med histologiska metoder, protein-bound zinc kan inte visualiseras2. Denna funktion har utnyttjats för att avslöja den synaptiska zink mönstret i olika kortikala regioner och synaptic zink histokemi har använts i ett antal studier. En delmängd av glutamatergic nervceller i hjärnbarken innehåller zink i de presynaptiska blåsor inom deras axon Terminal3,4. Histochemical studier har visat en heterogen fördelning av synaptic zink i hjärnbarken5,6,7. Det verkar finnas en annan areal och laminär fördelning av histochemically reaktiv zink i olika kortikala regioner (t.ex., visuell kontra somatosensoriska cortex) eller lager (t.ex.zink nivåer i supragranular och infragranular lager av primära syncentrum är betydligt högre än i thalamocortical inmatningslagret IV med relativt låg synaptic zink nivåer)5,8,9. Heterogenitet i synaptic zink färgning observerades i cortex är särskilt fördelaktigt eftersom det underlättar areala och laminär identifiering.
Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av synaptic zink histochemical förfarande, som är en modifierad version av Danscher’s 1982 metod10. Denna metod använder selenit injiceras intraperitonealt (IP) till djur som en kelatbildare. Selenit reser till hjärnan att reagera med pool av gratis zink Funna i blåsor av en delmängd av glutamatergic synapser i hjärnan. Denna reaktion ger en fällning som därefter kan förbättras genom silver utveckling2,10,11.
Detta förfarande avslöjar laminär och areala mönster av synaptic zink färgning; Densitometrisk analys kan användas för att bedöma dessa mönster både kvalitativt och kvantitativt i vuxen och omogna hjärnan för att studera effekter av andra insatser, såsom sensorisk, miljö, farmakologiska eller genetiska manipulationer. Dessutom kanske man också vill bedöma potentiella utvecklingsmässiga förändringar i fördelningen av synaptic zink i andra kortikala och subkortikala strukturer i andra modellsystem. Den kvantitativa information som Densitometrisk analys ger i denna metod kan vara fördelaktigt för följande hjärnans utveckling över tiden. Detta protokoll ger en följeslagare till andra immuno- och histochemical markörer för att avslöja laminär och areala gränser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella studien sysselsätter en histochemical teknik baserad på en modifierad version av Danscher (1982) metod10, whereby synaptic zink lokalisering kan upptäckas och visualiseras i hjärnan. Denna metod fungerar i huvudsak genom att injicera djuret med zink kelator natrium selenit (Na2SeO3) (15 mg/kg). Efter injektion av selenit reser till hjärnan och binder till gratis zink som är lokaliserade till presynaptiska blåsor av zink som innehåller neuroner. Zink joner…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (2G12RR03060-26A1); National Institute on minoritet hälsa och hälsa skillnader (8G12MD007603-27) från de National institutionerna of Health; Professionell personal kongressen-City University of New York (PSC-CUNY); och fakulteten Research Grant (FRG II) amerikanska universitetet i Sharjah. Vi tackar Vidyasagar Sriramoju för att införa oss till dessa metoder.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
References
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
