التصور إكسون ثالاموكورتيكال المتفرعة والمشبك تشكيل في كوكولتوريس أورجانوتيبيك
Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة لتصوير المتزامن ثالاموكورتيكال إكسون المتفرعة والمشبك تكوين في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المهاد وقشرة الدماغ. محاور عصبية ثالاموكورتيكال الفردية وعلى محطات presynaptic هي تصور بتقنية انهانسر خلية مفردة مع دسريد وسينابتوفيسين معلم التجارة والنقل.
Abstract
تشكيل المتفرعة والمشبك إكسون هي العمليات الحاسمة لإنشاء دوائر الخلايا العصبية الدقيقة. خلال التنمية، وتشكل محاور عصبية حسية ثالاموكورتيكال (TC) فروع ونقاط الاشتباك العصبي في طبقات معينة من قشرة الدماغ. على الرغم من المكانية علاقة متبادلة واضحة بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك، هو غير مفهومة العلاقة السببية بينهما. لمعالجة هذه المسألة، ونحن مؤخرا بوضع طريقة لتصوير المتزامن لتشكيل محاور عصبية TC الفردية في كوكولتوريس أورجانوتيبيك المتفرعة والمشبك.
ويصف هذا البروتوكول أسلوب الذي يتكون من مجموعة من كوكولتوري أورجانوتيبيك وانهانسر. كوكولتوريس أورجانوتيبيك من قشرة الدماغ والمهاد يسهل التلاعب بالجينات ومراقبة العمليات محواري، الحفاظ على هياكل مميزة مثل تكوين الصفحي. والبلازميدات مميزة اثنين ترميز دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) تم transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك بأسلوب انهانسر. هذه الطريقة سمحت لنا بتصور مورفولوجيس محواري الفردية TC الخلايا العصبية ومواقعهم بريسينابتيك في وقت واحد. كما مكن الأسلوب المراقبة الطويلة الأمد التي كشفت عن العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
Introduction
الإسقاط ثالاموكورتيكال (TC) في الدماغ الثدييات نظام مناسب للتحقيق في إرشادات إكسون واستهداف الآليات. خلال التنمية، وتنمو الحواس TC محاور عصبية في لوحة القشرية، وفروع النموذج ونهايات تفضيلي في طبقة الرابع الابتدائي المناطق الحسية في قشرة الدماغ1،2. حتى بعد إقامة اتصالات أساسية، يتم تشكيلها محواري العرش ومحطات متشابك تبعاً للتغيرات البيئية3،4. ومع ذلك، غير هو مفهومة كيف يتم تبديل مورفولوجيا إكسون TC بشكل حيوي. أحد الأسباب الرئيسية هو عدم وجود أسلوب كافية لمراقبة التغيرات الهيكلية على مستوى خلية واحدة. على الرغم من أن التطورات الأخيرة في الفحص المجهري، مثل الفحص المجهري اثنين-فوتون، السماح للمراقبة المباشرة لمعيشة الخلايا العصبية القشرية في فيفو، هناك قيود لا تزال التقنية للالتقاط الإجمالي TC المسارات5، 6-ولذلك، أساليب في المختبر لتصوير مباشر من محاور عصبية TC سيوفر أدوات قوية لتحليلات الهيكلية لتشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
مجموعتنا للمرة الأولى إنشاء أسلوب ثقافة شريحة ثابتة مع نفاذية الأغشية7. باستخدام هذا الأسلوب، كان كوكولتوريد شريحة القشرية الفئران مع كتلة ثالاميك حسية، وقد لخص الصفيحة الخاصة TC اتصالات في هذا7،كوكولتوريس أورجانوتيبيك8. كذلك وسم متفرق مع بروتين فلوري سمح لنا بمراقبة نمو إكسون TC وفرع تشكيل9،،من1011. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتصوير المتزامن التفريع والمشبك تشكيل محاور عصبية TC الفردية في أورجانوتيبيك كوكولتوريس12. تصور TC محاور عصبية ومواقع بريسينابتيك في نفس الوقت، كانت دسريد ومعلم اجفب سينابتوفيسين (ليرة سورية-اجفب) transfected شارك في عدد صغير من الخلايا العصبية ثالاميك انهانسر كوكولتوري أورجانوتيبيك. الأسلوب الحالي يسهل تحليل الخصائص المورفولوجية لمحاور عصبية TC ويسمح بالمراقبة الطويلة الأجل، التي يمكن أن تستخدم لإظهار العلاقة السببية بين تشكيل محور عصبي المتفرعة والمشبك.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول الحالي أيضا أداة قوية لدراسة الجوانب الإنمائية لتزايد محاور عصبية أخرى غير إسقاط ح11. على سبيل المثال، يسمح الجمع بين الثقافة شريحة القشرية وتقنية انهانسر تصور مورفولوجيا محواري الفردية من الخلايا العصبية القشرية وطويلة الأجل الملاحظة9،<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أيضا اليد غابرييل لقراءة نقدية.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
