Görselleştirme Thalamocortical Axon dallanma ve sinaps oluşumunda Organotypic Cocultures
Summary
Bu iletişim kuralı thalamocortical akson dallanma ve synapse oluşumu organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks eşzamanlı görüntüleme için bir yöntemi açıklar. Bireysel thalamocortical akson ve presynaptic onların terminalleri bir tek hücre çoğalmasıyla tekniği ile DsRed ve synaptophysin GFP öğesini tarafından görüntülenmiştir.
Abstract
Axon dallanma ve synapse oluşumu kesin nöronal devreler kurmak için çok önemli işlemler vardır. Geliştirme sırasında duyusal thalamocortical (TC) aksonlar serebral korteksin belirli katmanlar halinde şube ve sinapslarda oluştururlar. Axon dallanma ve synapse oluşumu arasında bariz uzamsal ilişki rağmen aralarındaki nedensel ilişki kötü anlaşılmaktadır. Bu sorunu gidermek için son zamanlarda bireysel TC aksonlar organotypic cocultures içinde dallanma ve synapse oluşumu aynı anda görüntüleme için bir yöntem geliştirdi.
Bu iletişim kuralı bir organotypic coculture ve elektroporasyon birleşimini içerir bir yöntemini açıklar. Organotypic cocultures, talamus ve serebral korteks gen manipülasyon ve gözlem Laminer yapılandırması gibi karakteristik yapıları koruyarak aksonal süreçlerin kolaylaştırmak. DsRed ve EGFP etiketli synaptophysin (SYP-EGFP) kodlama iki ayrı plazmid talamik nöronların az sayıda bir adım tekniği ile birlikte transfected. Bu yöntem TC nöronların bireysel aksonal türleri morfoloji ve presynaptic siteleri aynı anda görselleştirmek izin verdi. Yöntemi Ayrıca axon dallanma ve synapse oluşumu arasındaki nedensel ilişkiyi ortaya uzun vadeli gözlem etkin.
Introduction
Thalamocortical (TC) projeksiyon memeli beyinde axon rehberlik ve mekanizmaları hedefleme araştırmak için uygun bir sistemdir. Geliştirme sırasında duyusal TC aksonlar kortikal plaka ve formu şube ve sinapslarda tercihen içinde katman IV serebral korteks1,2birincil duyusal alanda büyümek. Temel bağlantılar kurulması sonra bile, aksonlar arbors ve sinaptik terminalleri çevresel değişiklikler3,4bağlı olarak yenilenmiş. Ancak, nasıl TC axon Morfoloji dinamik olarak değiştirilmez kötü anlaşılmaktadır. Bir tek hücre düzeyinde yapısal değişiklikleri gözlemlemek için yeterli bir teknik eksikliği ana nedenlerinden biri. Mikroskobu, İki fotonlu mikroskobu gibi son gelişmeler yaşayan kortikal nöronlar vivo içindedoğrudan gözlem izin vermiş, ancak genel TC yörüngeleri5, yakalamak için hala teknik sınırlamalar vardır 6. bu nedenle, vitro yöntemleri TC aksonlar canlı görüntüleme için axon dallanma ve synapse oluşumu yapısal analiz için güçlü araçlar sağlamak.
Bizim grup ilk kez bir statik dilim kültür yöntemi geçirgen membran7ile kurulmuş. Bu yöntemi kullanarak, bir sıçan kortikal dilim bir duyusal talamik blok ile cocultured ve lamina özgü TC bağlantıları bu organotypic cocultures7,8‘ recapitulated. Seyrek bir floresan protein ile etiketleme daha fazla TC axon büyüme ve dal oluşumu9,10,11gözlemlemek için bize izin. Son zamanlarda, dallanma, aynı anda görüntüleme için yeni bir yöntem geliştirdik ve bireysel TC aksonlar organotypic sinaps oluşumu12cocultures. TC akson ve presynaptic siteleri aynı anda görmek için DsRed ve EGFP etiketli synaptophysin (SYP-EGFP) talamik nöronların az sayıda organotypic coculture elektroporasyon tarafından ortak transfected. Geçerli yöntem TC aksonlar morfolojik analizi kolaylaştırır ve akson dallanma ve synapse oluşumu arasındaki nedensel ilişkiyi göstermek için kullanılan uzun vadeli gözlem için sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geçerli protokol de TC projeksiyon11dışında aksonlar büyüyen gelişim yönü eğitim için güçlü bir araçtır. Örneğin, kortikal dilim kültür ve elektroporasyon tekniği bir arada bireysel aksonal Morfoloji kortikal nöronlar ve uzun vadeli gözlem9,18görselleştirme sağlar.
Geçerli iletişim kuralını kullanarak, ilginç genler axon dallanma ve sinaps oluşumunda rol de floresan proteinler ve …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ayrıca Gabriel Hand eleştirel okuma için teşekkür ediyoruz.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
