Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures
Summary
Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.
Abstract
Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.
Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.
Introduction
La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología de axon de TC es mal entendida. Una de las principales razones es la falta de una adecuada técnica para observar los cambios estructurales a nivel unicelular. Aunque los acontecimientos recientes en microscopía, tales como microscopia de dos fotones, han permitido la observación directa de las neuronas corticales de vivo en vivo, hay limitaciones todavía técnicas para capturar el total TC trayectorias5, 6. por lo tanto, en vitro métodos para la proyección de imagen viva de axones de TC serían proporcionar herramientas poderosas para el análisis estructurales de la formación de ramas y sinapsis axón.
Nuestro grupo por primera vez estableció un método de cultura estática de la rebanada con membrana permeable7. Usando este método, una porción cortical de la rata fue morfología con un bloque sensorial talámico, y conexiones de TC de lámina específica fueron recapituladas en este organotypic cocultures7,8. Etiquetado escasa con una proteína fluorescente más nos permitió observar crecimiento del axon de TC y rama formación9,10,11. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método para la proyección de imagen simultánea de ramificación y formación de sinapsis de axones individuales de TC en el organotypic cocultures12. Para visualizar simultáneamente TC axones y sitios presinápticos, DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por electroporación de la organotypic cocultivo. El método actual facilita el análisis morfológico de los axones de TC y permite la observación a largo plazo, que puede utilizarse para demostrar la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC11. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación9,18.
Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formaci?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
También agradecemos a Gabriel Hand para lectura crítica.
Materials
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Hanks’ balanced salt solution (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulin | Sigma | I6634 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
| Sodium selenite | Wako Pure Chemical Industries |
192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries |
16806-25 | |
| 35 mm petri dishes | Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM insert | Millipore | PICMORG50 | |
| 100 mm petri dishes | BIO-BIK | I-90-20 | petri dish sterrile |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
| Disposable sterile plastic pipettes | 202-IS | transfer pipets sterile | |
| Glass capillary: OD 1.2 mm | Narishige | G-1.2 | inner diameter, 1.2 mm |
| Silver wire: 0.2 and 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diameter, 0.2 mm), AG-401485 (diameter, 1.0 mm) | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| Stimulator | A.M.P.I | Master 8 | |
| Biphasic isolator | BAK ELECTRONICS | BSI-2 | |
| Amplifier | A-M Systems | Model 1800 | |
| Oscilloscope | Hitachi | VC-6723 | |
| Manipulator | Narishige | SM-15 | |
| Micromanipulator | Narishige | MO-10 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ40 | |
| Universal stand | Olympus | SZ-STU2 | |
| Light illumination system | Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | |
| Electrode puller | Narishige | PC-10 | |
| Confocal microscope | Nikon | Digital eclipse C1 laser | |
| x20 objective | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Culture chamber | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rat | Japan SLC and Nihon-Dobutsu | ||
| Microsurgery scissors | Natsume | MB-54-1 |
References
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical development: how are we going to get there. Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).
- Espinosa, J. S., Stryker, M. P. Development and plasticity of the primary visual cortex. Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).
- Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biol. 3 (8), 272 (2005).
- Holtmaat, A., Svoboda, K. Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain. Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).
- Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. Dendritic spine dynamics. Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations. Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).
- Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures. J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).
- Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching. J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).
- Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices. Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).
- Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity. Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).
- Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures. Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).
- Molnar, Z., Blakemore, C. Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture. Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).
- Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).
- Yamamoto, N., et al. Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons. J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).
- Yamamoto, N., et al. Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons. J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).
- Ohnami, S., et al. Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching. J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).
- Yamada, A., et al. Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).
