Aplicação do sistema de cultura Aorta-gônada-mesonephros explante na hematopoiese do desenvolvimento
Summary
Este protocolo descreve o uso culto Aorta-gônada-Mesonephros para análises de expressão, unidades formadoras de colônia, na cultura e baço e reconstituição de longo prazo para determinar o efeito de fatores regulatórios e vias de sinalização no tronco hematopoiético desenvolvimento da célula. Isto foi demonstrado como um sistema eficaz para estudar a função e biologia de células-tronco hematopoiéticas.
Abstract
A limitação do uso de embriões do rato para estudos de hematopoiese é o inconveniente adicional nas operações, que é em grande parte devido ao desenvolvimento intra-uterino do embrião. Embora os dados genéticos de camundongos nocaute (KO) são convincentes, não é realista para gerar camundongos KO para todos os genes, conforme necessário. Além disso, realizando na vivo resgate experiências para consolidar os dados obtidos de camundongos KO não é conveniente. Para superar essas limitações, a cultura de explante de Aorta-gônada-Mesonephros (AGM) foi desenvolvida como um sistema adequado para estudar o desenvolvimento de células-tronco hematopoiéticas (HSC). Especialmente para as experiências de resgate, ele pode ser usado para recuperar a hematopoiese prejudicada em camundongos KO. Adicionando os produtos químicos apropriados entram no meio, a sinalização deficiente pode ser reactivada ou vias acima-regulada podem ser inibidas. Com o uso desse método, muitos experimentos pode ser realizada para identificar os reguladores críticos de desenvolvimento do HSC, incluindo HSC relacionados a expressão gênica em níveis de mRNA e proteína, capacidade de formação de colônia e capacidade de reconstituição. Esta série de experimentos seria útil na definição dos mecanismos subjacentes essenciais para o desenvolvimento de HSC em mamíferos.
Introduction
Células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) são células-tronco tecido-específica adultas que possuem potencial multilineage incluindo eritroide, mieloide e células linfoides, bem como a capacidade de se renovar. Estudos recentes têm mostrado que os primeiros linfócitos surgiram de uma população endotelial especializada, conhecida como endotélio hemogenic (ele), através o endotelial de transição hematopoiética (EHT) na parede ventral da aorta dorsal1,2 ,3,4. Uma vez formado na aorta-gônada-mesonephros (AGM) região de embrionária (E) 10.5 para E12.5 do embrião de rato, linfócitos irão migrar para o fígado fetal para expansão e finalmente colonizar a medula óssea para manter a hematopoiese adulta ao longo da vida do indivíduo 5 , 6. embora isto tem sido estudado por muitos anos, os mecanismos subjacentes de HSC surgimento e desenvolvimento permanecem incompletamente compreendidos.
Ao contrário de fertilização in vitro e desenvolvimento de embriões de peixe-zebra, desenvolvimento intra-uterino de embriões do rato torna o estudo da hematopoiese definitivo durante a embriogênese muito mais inconveniente. Apesar de experiências genéticas usando camundongos nocaute (KO) são comumente utilizadas, a falta de alguns ratos KO também limita a sua utilização no campo de pesquisa hematopoiéticas. Além disso, na vivo experiências de resgate não são facilmente realizadas em camundongos KO. Desde 1996, a cultura de explant AGM foi desenvolvida para estudos hematopoiéticos pelos pioneiros no campo7. Com a ajuda deste sistema de cultura, tecidos ventrais da região AGM foram identificados para promover a atividade HSC, enquanto tecidos dorsais exercem um oposto efeito8,9. O sistema de cultura de explant AGM também foi aplicado para determinar as funções da serotonina, Mpl, SCF, BMP e ouriço sinalização em HSC desenvolvimento10,11,12,13, 14. importante, é também um método popular usado para resgatar hematopoiéticos defeitos em embriões mutantes13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
É sabido que linfócitos maduros na medula óssea podem repovoar o sistema sanguíneo de destinatários irradiados. Ao contrário destes linfócitos funcionais, os linfócitos emergentes em assembleia geral de embriões do rato são imaturos. Resultados de transplante direto mostraram esse tipo eu (VE-cad+ CD45– CD41+) e tipo II (VE-+ CD45 cad+) pré-linfócitos possuem nenhuma capacidade de reconstituição20. Aproveitando o sistema de cul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Suwei Gao para ajudar na preparação de figura. Este trabalho foi apoiado por concessões do Nacional Natural Science Foundation da China (81530004, 31425016) e o Ministério da ciência e tecnologia da China (2016YFA0100500). J.L. realizou os experimentos e elaborou o manuscrito; F.L. editado o manuscrito. Ambos os autores ler e aprovaram o manuscrito final.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
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