Summary

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Published: November 03, 2017
doi:

Summary

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Abstract

Hematopoiesis çalışmalar için fare embriyo kullanarak sınırlama operasyonlarında, hangi büyük ölçüde embriyo intrauterin gelişme nedeniyle eklenen rahatsızlık ‘s. Nakavt (KO) fareler genetik verileri ikna edici rağmen KO fareler tüm genler için gerektiği gibi oluşturmak için gerçekçi değildir. Ayrıca, in vivo gerçekleştirme KO fareler elde edilen verileri birleştirmek için kurtarma deneyler değil uygun. Bu sınırlamalarını aşmak için aort-erbezi-Mesonephros (AGM) explant kültür hematopoetik kök hücre (HSC) geliştirme eğitim için uygun bir sistem olarak geliştirilmiştir. Özellikle kurtarma denemeleri için bu KO farelerde Engelli hematopoiesis kurtarmak için kullanılabilir. Uygun kimyasallar orta ekleyerek, Engelli sinyal yeniden etkinleştirilebilir veya yukarı düzenlenir yolları inhibe olabilir. Bu yöntemin kullanılması, birçok deney HSC gelişiminin kritik düzenleyiciler tanımlamak için gerçekleştirilen, HSC gen ekspresyonu mRNA ve protein düzeyleri, koloni oluşumu yeteneği ve sulandırma kapasitesi ile ilgili. Bu dizi deney memelilerde HSC gelişimi için gerekli temel mekanizmaları tanımlamada yardımcı olabilir.

Introduction

Hematopoetik kök hücre (HSCs) erythroid, myeloid, dahil olmak üzere multilineage potansiyel ve lenfoid hücrelerin yanı sıra kendi kendini yenileme yeteneği sahip doku özgü erişkin kök hücreleri vardır. Erken HSCs hemogenic endotel (HE), bilinen bir popülasyondan özel endotel, endotel dorsal aort1,2 ventral duvar, hematopoetik geçiş (EHT) aracılığıyla ortaya çıkan son çalışmalar göstermiştir ,3,4. Aort-erbezi-mesonephros (AGM) bölgede embriyonik (E) 10,5 dan E12.5 için fare embriyo oluşan bir kez HSCs fetal karaciğer için genişleme içine göç ve son olarak bir kişinin hayatı boyunca yetişkin hematopoiesis korumak için kemik iliği kolonize 5 , 6. her ne kadar bu uzun yıllar boyunca inceledi, HSC ortaya çıkması ve geliştirme temel mekanizmaları tam olarak anlaşılır kalır.

Vitro fertilizasyon ve Zebra balığı embriyo gelişimi, intrauterin fare embriyo gelişimi sırasında embriyogenez kesin hematopoiesis çalışma çok daha rahatsız edici yapar. Belirli KO fareler eksikliği de hudut onların kullanma-hematopoetik araştırma alanındaki her ne kadar genetik deneyler nakavt (KO) fare kullanarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, in vivo kurtarma denemeleri kolayca KO fareler gerçekleştirilemiyor. 1996 yılından bu yana, AGM explant kültür hematopoetik çalışmaları için alan7öncüleri tarafından geliştirilmiştir. Bu kültür sistemi sayesinde, AGM bölge ventral dokuların bir ters etkisi8,9dorsal doku uygulamayın iken HSC etkinlik, tanıtmak için tespit edilmiştir. AGM explant kültür sistemi aynı zamanda Serotonin, Mpl, SCF, BMP ve kirpi HSC geliştirme10,11,12,13, sinyal rolleri belirlemek için uygulanan 14. önemli, bu da mutant embriyo13,15dakika sonra hematopoetik kusurları kurtarmak için kullanılan popüler bir yöntemdir.

Protocol

hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları zooloji Enstitüsü, Çin Bilimler Akademisi, Pekin, Çin için etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olan. 1. malzeme hazırlık Sterilize 0.65 µm filtreleriyle ultraviyole ışınları ultraviyole altında üretilen ışın 4 h için temiz bankta lamba ve 2 h işaretinden sonra filtreleri teslim. Not: UV ışık ile çalışırken, uygun koruma giymek. Paslanmaz çelik kafesler 30 ortaçağ ha…

Representative Results

Son yayın AGM13′ te pro-apoptotik yolu engelleyerek endotel hücre kaynaklı serotonin HSCs yaşama teşvik bildirdi. HSC geliştirme teşvik etkisi serotonin onaylamak için fluoksetin dahil edildi. Bir selektif serotonin re-uptake inhibitörü olarak (SSRI), fluoksetin serotonin yeniden emme periferik dokulara16,17,18etkisizleştirmek için kanıtlanmıştır. AGM kulla…

Discussion

İyi olgun HSCs kemik iliğinde kan sistemi radyasyonlu alıcılarının yeniden doldurabilir bilinmektedir. Bu işlev HSCs farklı olarak, fare embriyo AGM içinde ortaya çıkan HSCs olgunlaşmamış. Doğrudan nakli sonuçlar gösterdi bu tür ben (VE-cad+ CD45 CD41+) ve tip II (VE-cad+ CD45+) pre-HSCs sahip hiçbir sulandırma yeteneği20. AGM explant kültür sistemi, AGM bölgedeki doğmakta olan HSCs yararlanarak alıcıları ekimi tah…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz Suwei Gao şekil hazırlık yardım için teşekkür ederim. Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81530004, 31425016) ve Bilim Bakanlığı ve Çin teknoloji (2016YFA0100500) tarafından desteklenmiştir. JL deneyler gerçekleştirilen ve el yazması hazırlanan; Tayback el yazması düzenlenmiş. Her iki yazar okuyun ve son el yazması onayladı.

Materials

durapore 0.65 µm filters Millipore R5BA63787 AGM explant culture
M5300 long-term culture medium Stem Cell Technologies 5300 AGM explant culture
Trizol  Tiangen 5829 RNA extration
M-MLV reverse transcriptase Promega 90694 reverse transcription
SYBR Green Qiagen A6002 quantatitive real-time PCR
protease inhibitor Roche 55622 Protein extration
collagenase Sigma C2674 digestion of AGM tissues
MethoCult GF M3434 medium Stem Cell Technologies 3434 CFU-C assay
ultra-low attachment 24-well plates Costar 3473 CFU-C assay
C57BL/6 CD45.2 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd CFU-S assay
C57BL/6 CD45.1 mice Beijing HFK Bioscience Co. Ltd Long-term transplantation
phosphate buffered saline Life Technologines 8115284 AGM Collection
Penicillin-Streptomycin solution HyClone SV30010 AGM explant culture
anti-CD45.2-PE-CY7 eBioscience 25-0454-80 Long-term transplantation
anti-CD45-FITC eBioscience 11-0451-81 Long-term transplantation
UV lamp Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD 039-14402 power: 30W
stainless steel mesh AS ONE SHANGHAI Corporation 2-9817-10  aperture diameter: 2.5 mm
hydrocortisone Sigma H0396 selectively diluted into M5300 medium

References

  1. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  2. Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
  3. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  4. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
  5. Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
  6. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  7. Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
  8. Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
  9. Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
  10. Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
  11. Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
  12. Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
  13. Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
  14. Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
  15. Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
  16. Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
  17. Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
  18. Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
  19. Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
  20. Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
  21. Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).

Play Video

Cite This Article
Lv, J., Liu, F. Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis. J. Vis. Exp. (129), e56557, doi:10.3791/56557 (2017).

View Video