Tillämpningen av Aorta-gonad-mesonephros Explant kultur System i utvecklingsmässiga blodbildning
Summary
Det här protokollet beskriver använder odlade Aorta-Gonad-Mesonephros för uttryck analyser, kolonibildande enheter i kultur och mjälte och långsiktiga beredning för att bestämma effekten av reglerande faktorer och signalvägar på hematopoetiska stamceller cell utveckling. Detta har påvisats som ett effektivt system för att studera hematopoetiska stamcellsbiologi och funktion.
Abstract
Begränsning av använda musembryon för blodbildning studier är extra besväret i verksamheten, vilket till stor del beror på intrauterin utvecklingen av embryot. Även om genetiska data från knockoutmöss (KO) är övertygande, är det inte realistiskt att generera KO möss för alla gener som behövs. Dessutom utför i vivo rescue experiment att konsolidera data från KO möss är inte bekvämt. För att övervinna dessa begränsningar, utvecklades Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant kulturen som ett lämpligt system att studera hematopoetiska stamceller (HSC) utveckling. Särskilt för räddning experiment, kan det användas till återvinna den försämrad blodbildningen i KO möss. Genom att lägga till lämpliga kemikalier i mediet, den nedsatt signalering kan återaktiveras eller uppreglerat vägar kan hämmas. Med användning av denna metod, många experiment kan utföras för att identifiera kritiska tillsynsmyndigheterna för HSC utveckling, däribland HSC besläktade genuttryck på mRNA och protein nivåer, koloni bildandet förmåga och beredning kapacitet. Denna serie experiment skulle vara till hjälp i att definiera vilka underliggande mekanismer som är nödvändiga för HSC utveckling hos däggdjur.
Introduction
Hematopoetiska stamceller (Förenta) är vävnadsspecifika adulta stamceller som besitter Multilinjärt potential inklusive erytroid, myeloisk, samt lymfoida celler och förmågan att själv förnya. Nyare studier har visat att de tidigaste Förenta uppstod från en specialiserad endothelial befolkning, känd som hemogenic endotel (han), genom den endothelial hematopoetiska övergång (EHT) på den ventrala väggen av dorsala aorta1,2 ,3,4. När bildades aorta-gonad-mesonephros (AGM) regionen från embryonala (E) 10,5 till E12.5 i mus embryot, kommer att Förenta migrera in i fostrets levern för expansion och slutligen kolonisera benmärgen för att upprätthålla vuxen blodbildning hela individens liv 5 , 6. Trots detta har studerats under många år, de bakomliggande mekanismerna för HSC uppkomst och utveckling förbli ofullständigt förstådda.
Till skillnad från in vitro- befruktning och utveckling av zebrafisk embryon gör intrauterin utveckling av musembryon studien av slutgiltiga blodbildning under embryogenes mycket mer obekväm. Även om genetiska experiment med knockoutmöss (KO) används ofta, begränsar bristen på vissa KO möss också deras användning i forskningsfältet hematopoetiska. I vivo rescue experiment utförs dessutom inte enkelt i KO möss. Sedan 1996 har årsstämman explant kulturen utvecklats för hematopoetiska studier av pionjärerna i fält7. Med hjälp av denna kultur system, har ventrala vävnader i regionen AGM identifierats för att främja HSC aktivitet, medan dorsala vävnader utöva en motsatt effekt8,9. Årsstämman explant kultur systemet har också använts för att fastställa rollerna för Serotonin, Mpl, SCF, BMP och Hedgehog-signalering i HSC utveckling10,11,12,13, 14. viktigast av allt, det är också en populär metod som används för att rädda hematopoetiska defekter i mutant embryon13,15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det är väl känt att mogna Förenta i benmärgen kan återbefolka blodsystemet av bestrålade mottagare. Till skillnad från dessa funktionella Förenta är de framväxande Förenta i årsstämma i musembryon omogna. Direkta transplantation resultaten visade den typen jag (VE-cad+ CD45– CD41+) och typ II (VE-cad+ CD45+) pre-Förenta besitter ingen beredning förmåga20. Dra nytta av AGM explant kultur systemet, de begynnande Förenta i reg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Suwei Gao för hjälp i figur förberedelse. Detta arbete stöds av bidrag från den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (81530004, 31425016) och ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2016YFA0100500). J.L. utfört experimenten och utarbetat manuskript; F.L. redigerade manuskriptet. Båda författarna läst och godkänt det slutliga manuskriptet.
Materials
| durapore 0.65 µm filters | Millipore | R5BA63787 | AGM explant culture |
| M5300 long-term culture medium | Stem Cell Technologies | 5300 | AGM explant culture |
| Trizol | Tiangen | 5829 | RNA extration |
| M-MLV reverse transcriptase | Promega | 90694 | reverse transcription |
| SYBR Green | Qiagen | A6002 | quantatitive real-time PCR |
| protease inhibitor | Roche | 55622 | Protein extration |
| collagenase | Sigma | C2674 | digestion of AGM tissues |
| MethoCult GF M3434 medium | Stem Cell Technologies | 3434 | CFU-C assay |
| ultra-low attachment 24-well plates | Costar | 3473 | CFU-C assay |
| C57BL/6 CD45.2 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | CFU-S assay | |
| C57BL/6 CD45.1 mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd | Long-term transplantation | |
| phosphate buffered saline | Life Technologines | 8115284 | AGM Collection |
| Penicillin-Streptomycin solution | HyClone | SV30010 | AGM explant culture |
| anti-CD45.2-PE-CY7 | eBioscience | 25-0454-80 | Long-term transplantation |
| anti-CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-81 | Long-term transplantation |
| UV lamp | Beijing jiangmorning yuan bio-technology co., LTD | 039-14402 | power: 30W |
| stainless steel mesh | AS ONE SHANGHAI Corporation | 2-9817-10 | aperture diameter: 2.5 mm |
| hydrocortisone | Sigma | H0396 | selectively diluted into M5300 medium |
References
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Boisset, J. C., Robin, C. Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta. Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).
- Kumaravelu, P., et al. Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver. Development. 129, 4891-4899 (2002).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86, 897-906 (1996).
- Peeters, M., et al. Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development. Development. 136, 2613-2621 (2009).
- Taoudi, S., Medvinsky, A. Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta. PNAS. 104, 9399-9403 (2007).
- Crisan, M., et al. BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo. Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).
- Durand, C., et al. Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells. PNAS. 104, 20838-20843 (2007).
- Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis. Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).
- Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. 5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival. J Exp Med. 214, 529-545 (2017).
- Souilhol, C., et al. Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells. Nature communications. 7, 10784 (2016).
- Fitch, S. R., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).
- Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes. Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).
- Ortiz, J., Artigas, F. Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine. Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).
- Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine. Life sciences. 15, 471-479 (1974).
- Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter. Nature. 457, 887-891 (2009).
- Rybtsov, S., et al. Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region. J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).
- Muthuswamy, S. K. Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead. Development. 144, 963-967 (2017).
