Udkig efter Driver veje af erhvervet modstand mod målrettede terapi: resistente Subclone Generation og følsomhed gendannelse af genet Knock-down

Summary

Dette er en tid og omkostninger effective in vitro- protokollen at undersøge mekanismerne af erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, som er en yderst udækket medicinsk behov i kræft forvaltning.

Abstract

De seneste to årtier har set et skift fra cytotoksiske stoffer til målrettet terapi i medicinsk onkologi. Selv om målrettede terapeutiske agenter har vist mere imponerende klinisk effekt og minimerede bivirkninger end traditionelle behandlinger, er resistens over for lægemidler blevet den største begrænsning til deres ydelser. Flere prækliniske undersøgelser/in vitro- / in vivo modeller af erhvervet modstand mod målrettede agenter i klinisk praksis er blevet udviklet hovedsageligt ved hjælp af to strategier: i) genetisk manipulation til modellering genotyper af erhvervet modstand, og ii) in vitro / in vivo udvalg af resistente modeller. I den nuværende arbejde foreslår vi en samlende ramme for at undersøge de underliggende mekanismer er ansvarlige for erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, startende fra generation af resistente cellulære subclones til beskrivelse af hæmning procedurer, der anvendes til at genoprette følsomheden til inhibitoren. Denne enkle tid og omkostninger effective tilgang er alment gældende og let kunne udvides for at undersøge resistensmekanismer til andre målrettede terapeutiske lægemidler i forskellige tumor histotypes.

Introduction

Opfølgning på de afgørende opdagelser i molekylær og cellulær biologi, er en række nye syntetiserede anticancer molekyler blevet udviklet for at selektivt målrette muterede signaling veje i en bred vifte af tumortyper. Navnlig to kategorier af målrettede terapeutiske agenter med unikke egenskaber i onkologi, nemlig syntetiske kemiske forbindelser og rekombinant monoklonale antistoffer, er kendt for at have opnået kliniske succeser og dramatisk ændret kræft pleje i de seneste årtier^1,2,3.

Alligevel, trods deres imponerende første respons på behandlingen, størstedelen af kræftpatienter har udviklet resistens over for lægemidler til alle målrettede terapeutiske agenter, både monoklonale antistoffer og kinase hæmmere. Som følge heraf er medicinresistens, den største hurdle for klassiske anti-cancer medicin⁴, stadig en stor udfordring for nye målrettede behandlinger^5,6.

Modstand mod målrettede terapi kan være iboende (dvs., primære) eller erhvervet (dvs.sekundære). Iboende modstand beskriver en de novo manglende respons på terapi, mens sekundære resistens opstår efter en periode med svar på stof behandling⁷. Sidstnævnte er forårsaget af udbrud af små årgange af tumorceller i hovedparten af den primitive tumor eller beliggende i distale kryptiske anatomiske nicher, udstiller op til 90% resistens over for et eller flere målrettede terapeutiske agenter. Molekylære mekanismer bag en resistens udvikling til målrettet behandling primært et resultat af target genmutationer og redundante aktivering af andre Pro overlevelse signaling veje, hvis forståelse er stadig langt fra komplet⁸.

I dette arbejde foreslog vi en tid og omkostninger effective tilgang for at undersøge i vitro mekanismer af erhvervet modstand mod målrettede terapeutiske agenter, startende fra generation af resistente cellulære subclones til beskrivelse af tavshed procedurer anvendes til genoprette følsomhed til inhibitor, et afgørende værktøj til test og validering af arbejdshypoteser. Især blev vores tilgang brugt til at undersøge, i mavekræft, resistensmekanismer til trastuzumab (fxHerceptin), en humaniseret monoklonalt antistof rettet mod det ekstracellulære domæne af HER2 protein⁹. Trastuzumab + kemoterapi er bredt accepteret som den standard første-linie behandling til HER2-positiv metastaserende brystkræft. Takket være de seneste prækliniske undersøgelser viser, at anti-HER2 behandlingsformer har betydelig aktivitet i både in vitro- og i vivo HER2-positive gastrisk kræft modeller^10,11, Molekylær medicin målretning HER2 har været grundigt undersøgt i kliniske forsøg, er hvoraf nogle stadig i gang, på patienter med gastroøsofageal kræft^12,13,14,15.

Disse undersøgelser har understreget det stigende antal patienter, der oplever resistens over for trastuzumab¹⁶, ligeledes til hvad er observeret for andre målrettet terapeutisk hæmmere. Især svarprocent af trastuzumab var 47%, og median samlet overlevelse for patienter på trastuzumab + kemoterapi var kun 2,7 måneder længere end for patienter i kemoterapi alene¹⁷. Dette foreslog, at mens primære trastuzumab modstand er fremherskende, sekundære trastuzumab modstand er uundgåelig. Af denne grund er der presserende behov for at præcisere de mekanismer, der forårsager HER2-målrettet terapi modstand i gastrisk kræft, som er endnu mere problematisk givet den samhandel tumorsygdomme genetiske heterogenitet af denne neoplasi¹⁸.

Derudover har mekanismer af resistens over for trastuzumab i mavekræft bevist udfordrende at forklare, delvist på grund af vanskeligheden ved at opnå pålidelige prækliniske modeller repræsentant af denne betingelse. Oshima et al. rapporterede en i vivo udvælgelsesmetode af trastuzumab-resistente gastrisk kræft cellelinjer, bestående af en gentagen kultur i en lille resterende peritoneal metastaser efter behandling med trastuzumab¹⁹. Men behovet for en indhegning, specifikke animalske håndtering ekspertise og godkendelse af dyr etiske komité bidraget til at gøre det en gang – og cost-forbrugende metode. Den tilgang, vi beskriver i dette arbejde er simpel og bredt anvendelig, og let kunne udvides for at undersøge resistensmekanismer til andre terapeutiske lægemidler i forskellige tumor histotypes²⁰.

Protocol

Bemærk: Denne protokol er blevet specifikt justeret til analyse af de underliggende erhvervet resistens over for trastuzumab af HER-positive gastrisk kræft cellelinjer mekanismer. Alle laboratorieinstrumenter nødvendige indberettes i Tabel af materialer. 1. generation af målrettet terapi resistente Subclones Bemærk: Dette er den mest kritiske og vanskeligt at standardisere trin i protokollen, at forskellige cellelinjer kan udvise forskellige føl…

Representative Results

Figur 1 beskriver rammerne af forsøgsmetoden. Tre gastrisk kræft celle-linjer giver udtryk for et højt niveau af HER2 og følsomme over for trastuzumab (IC50 < peak plasma niveau af narkotika, figur 2A, venstre graf) blev dyrket i kultur medium indeholdende den målrettede terapeutisk agens. En dosis 10-fold lavere end peak plasmakoncentration af trastuzumab (10 µg/mL) var placere nemlig den startdosis, og gradvist…

Discussion

Mens tilpassede og målrettede behandlinger har fremkaldt voksende begejstring, disse såkaldte “smarte” behandlingsformer står over for de samme store hurdle som traditionel kemoterapi narkotika, dvs., den hurtige og uforudsigelige erhvervelse af resistens over for lægemidler. For at forbedre resultaterne af målrettede terapi, skal resistens problemer løses gennem en bedre forståelse af de mekanismer, der forårsager dem. Her, præsenterede vi et bredt tilgængelige in vitro- metode til at unders?…

Materials

Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection