Alla ricerca di Driver delle vie di acquisito resistenza alla terapia mirata: generazione farmacoresistenti Subclone e sensibilità ripristino di Gene Knock-down
Summary
Si tratta di un protocollo di tempo e costi efficaci in vitro indagare i meccanismi della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, che è un bisogno medico altamente insoddisfatto in gestione del cancro.
Abstract
Negli ultimi due decenni hanno visto uno spostamento da farmaci citotossici a terapia mirata in oncologia medica. Anche se gli agenti terapeutici mirati hanno dimostrato efficacia clinica più impressionante e ridotto al minimo gli effetti negativi rispetto ai trattamenti tradizionali, farmacoresistenza è diventata la principale limitazione alla loro benefici. Diversi modelli preclinici/in vitro/in vivo di resistenza acquisita ad agenti mirati nella pratica clinica sono stati sviluppati utilizzando principalmente due strategie: manipolazione i) genetica per la modellazione di genotipi di resistenza acquisita e ii) in vitro / in vivo selezione dei modelli resistenti. Nel presente lavoro, proponiamo un quadro unificante, per indagare i meccanismi responsabili della resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione del le procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all’inibitore di silenziamento. Questo approccio semplice di tempo e costi efficaci è ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici mirati in istotipi differenti del tumore.
Introduction
In seguito le scoperte cruciali nella biologia molecolare e cellulare, un numero di nuove molecole antitumorali sintetizzati è stato sviluppato per mirare selettivamente oncogeniche vie di segnalazione in una vasta gamma di tipi di tumore. In particolare, composti di due categorie di agenti terapeutici mirati con proprietà uniche in oncologia, vale a dire sintetici chimici e anticorpi monoclonali ricombinanti, sono noti ad aver raggiunto successi clinici e cura del cancro drammaticamente alterato in ultimi decenni1,2,3.
Tuttavia, nonostante la loro impressionante risposta iniziale al trattamento, la maggior parte dei malati di cancro hanno sviluppato resistenza ai farmaci a tutti gli agenti terapeutici mirati, sia gli anticorpi monoclonali e gli inibitori della chinasi. Di conseguenza, farmacoresistenza, il grande ostacolo per farmaci anti-cancro classico4, è ancora una grande sfida per emergenti terapie mirate5,6.
Resistenza alla terapia mirata può essere intrinseco (cioè, primario) o acquisito (cioè, secondario). Resistenza intrinseca descrive una de novo in mancanza di risposta alla terapia, mentre la resistenza secondaria si verifica dopo un periodo di risposta alla droga trattamento7. Quest’ultimo è causato da focolai di piccole coorti di cellule del tumore all’interno della massa del tumore primitivo o immerso nelle nicchie anatomiche criptici distale, che esibiscono fino al 90% resistenza a uno o più mirati agenti terapeutici. Meccanismi molecolari alla base di uno sviluppo di resistenza alla terapia mirata principalmente il risultato di mutazioni del gene bersaglio e ridondante attivazione di altre vie di segnalazione pro-sopravvivenza, cui la comprensione è lungi dall’essere completa8.
In questo lavoro, abbiamo proposto un approccio a tempo e a costi efficaci per studiare in vitro i meccanismi di resistenza acquisita agli agenti terapeutici mirati, a partire dalla generazione di subcloni cellulari resistenti alla droga alla descrizione di silenziamento procedure utilizzate per ripristinare la sensibilità all’inibitore, uno strumento fondamentale utilizzato per testare e convalidare le ipotesi di lavoro. In particolare, il nostro approccio è stato usato per studiare, nel cancro gastrico, i meccanismi di resistenza al trastuzumab (per esempio, Herceptin), un anticorpo monoclonale umanizzato il dominio extracellulare di HER2 proteina9di targeting. Trastuzumab + chemioterapia è ampiamente accettata come il trattamento standard di prima linea per tumore mammario metastatico HER2-positivo. Grazie a studi preclinici recenti che mostrano quello anti-HER2 terapie hanno attività significativa in entrambi in vitro e in vivo il cancro gastrico HER2-positivi modelli10,11, farmaci molecolari destinazione HER2 sono stati ampiamente esaminato negli studi clinici, alcuni dei quali sono ancora in corso, su pazienti con gastroesofageo cancro12,13,14,15.
Questi studi hanno sottolineato il crescente numero di pazienti che avvertono la resistenza a trastuzumab16, similmente a ciò che è osservato per altri inibitori terapeutici mirati. In particolare, il tasso di risposta di trastuzumab era 47%, e la sopravvivenza globale mediana per i pazienti su trastuzumab + chemioterapia era solo 2,7 mesi più lungo per i pazienti in chemioterapia da solo17. Ciò ha suggerito che, mentre la resistenza primaria trastuzumab è prevalente, resistenza secondaria trastuzumab è inevitabile. Per questo motivo, c’è bisogno urgente di chiarire i meccanismi che causano la resistenza di terapia mirata di HER2 nel carcinoma gastrico, che è ancora più problematico dato l’eterogeneità genetica intra-tumorale di questa neoplasia18.
Inoltre, meccanismi di resistenza al trastuzumab nel cancro gastrico hanno dimostrato difficile da spiegare, parzialmente a causa della difficoltà nell’ottenere il rappresentante di modelli preclinici affidabili di questa circostanza. Oshima et al ha segnalato un metodo di selezione in vivo di linee cellulari di carcinoma gastrico trastuzumab-resistente, composto da una cultura ripetuta di piccola metastasi peritoneale residua dopo il trattamento con trastuzumab19. Tuttavia, la necessità di un recinto, di competenza di gestione specifica degli animali e dell’approvazione del Comitato di etica animale hanno contribuito a renderlo un metodo che richiede tempo e costi. L’approccio che descriviamo in questo lavoro è semplice e ampiamente applicabile e può essere facilmente estesa per studiare i meccanismi di resistenza ad altri farmaci terapeutici differenti del tumore istotipi20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre personalizzate e mirate terapie hanno suscitato entusiasmo crescente, queste cosiddette terapie ‘intelligente’ affrontano il grande ostacolo stesso come farmaci chemioterapici tradizionali, vale a dire, l’acquisizione rapida e imprevedibile di farmaco resistenza. Per migliorare i risultati della terapia mirata, farmaco-resistenza problemi devono essere risolti attraverso una migliore comprensione dei meccanismi che li provocano. Qui, abbiamo presentato una metodologia ampiamente accessibili in vitro <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Veronica Zanoni per la modifica il manoscritto.
Materials
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
| ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
| TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
| 4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
| Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
| Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
| Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
| opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
| Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
| Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
| goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
| PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
| Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
| Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
| Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
| Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |
References
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