타겟된 치료에 저항을 취득의 드라이버 경로 찾고: 약물 내성 Subclone 생성 및 감도 유전자 때 려 눕에 의해 복원

Summary

이것은 시간 및 비용 effective 생체 외에서 프로토콜의 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘을 조사 하는 암 관리에 높은 미 충족된 의료 필요 이다.

Abstract

지난 2 년간 의료 종양학에서 타겟된 치료 세포 독성 약물에서 변화를 보았다. 타겟된 치료제 더 인상적인 임상 효능과 전통적인 치료법 보다 부작용 최소화에 표시 하는 있지만 약물 저항 그들의 혜택을 주요 제한 되고있다. 임상 연습에 대상된 에이전트에 저항을 취득된의 여러 전 임상/생체 외에서 또는 vivo에서 모델 두 가지 전략을 사용 하 여 주로 개발 되었습니다: 인수 저항, 및 ii) 생체 외에서 의 genotypes 모델링 i) 유전자 조작 / vivo에서 저항 모델의 선택. 현재 작업에서 우리는 기본 메커니즘의 설명에 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 타겟된 치료제에 저항을 취득된에 대 한 책임을 조사 통합 프레임 워크를 제안 입을 절차는 억제 물 감도 복원에 사용. 간단한 시간 그리고 비용 effective 이렇게 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes에 다른 대상된 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사를 쉽게 확장할 수 있습니다.

Introduction

분자와 세포 생물학에 있는 중요 한 발견에 따라, 새로운 합성된 항 암 분자 수 선택적으로 종양 종류의 광범위 한 배열에 종양 신호 경로 대상으로 개발 되었습니다. 특히, 타겟된 치료제 종양학에서 독특한 속성의 두 가지 범주, 즉 합성 화학 화합물 및 재조합 단일 클론 항 체, 임상 성공 및 극적으로 변경 된 암 치료에서 달성 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근 수십 년간^1,2,3.

그럼에도 불구 하 고, 치료에 그들의 인상적인 초기 대응에도 불구 하 고 암 환자의 대부분 모든 타겟된 치료제, 단일 클론 항 체와 kinase 억제제 약물 저항을 개발 했습니다. 결과적으로, 약물 내성, 고전적인 항 암 약⁴에 대 한 주요 장애물은 여전히 신흥 표적으로 한 치료^5,6에 대 한 큰 도전.

타겟된 치료에 저항을 내장 될 수 있습니다 (즉, 기본) 또는 (즉, 보조)를 인수. 본질적인 저항 보조 저항 약물 치료⁷응답의 기간 후에 발생 하는 반면 치료, 응답의 드 노 보 부족을 설명 합니다. 후자는 기본 종양의 대부분 내의 종양 세포의 작은 동료의 발생으로 인 한 또는 원심 비밀 해 부 틈새에 자리 잡고 있으며, 최대 90%까지 전시 저항 하나 이상의 타겟 치료제. 기본 타겟된 치료에 저항 개발 주로 분자 메커니즘 대상 유전자 변이 그 이해 완료⁸멀지는 다른 프로 생존 신호 통로의 중복 활성화에서 유래한 다.

이 작품에서는, 우리는 시간 및 비용 effective 접근의 약물 내성 세포 subclones의 세대에서 시작 하는 침묵의 설명에 타겟된 치료제 인수 저항 메커니즘 체 외에서 조사 제안 사용 감도 억제제, 테스트 작업 가설의 유효성을 검사 하는 사용 되는 중요 한 도구를 복원 하는 절차. 특히, 우리의 접근은 조사, 위 암, trastuzumab (예를 들어, Herceptin), HER2 단백질⁹의 세포 외 도메인을 대상으로 인간 답게 단일 클론 항 체를 저항 메커니즘에에서 사용 되었다. Trastuzumab + 화학요법 HER2 양성 전이성 유방암에 대 한 표준 첫 줄 치료로 널리 인정 됩니다. 그 안티 HER2 보여주는 최근 전 임상 연구 덕분에 치료에 있는 중요 한 활동 둘 다 생체 외에서 그리고 HER2 양성 vivo에서 위 암 모델^10,11, HER2를 표적으로 하는 분자 약물 되었습니다. 임상 시험에서 광범위 하 게 검사, 일부는 여전히 지속적인 환자 위 식도 암^12,13,,1415에 있습니다.

이러한 연구 환자 trastuzumab¹⁶, 유사 하 게 어떤 다른 타겟된 치료 억제제에 대 한 관찰은 저항을 발생의 상승 수를 강조 했다. 특히, trastuzumab의 응답 속도 47%, 그리고 trastuzumab + 화학요법에 환자에 대 한 평균 전반적인 생존은 불과 2.7 개월 환자 화학 요법 혼자¹⁷에 대 한 이상. 이 기본 trastuzumab 저항 유행 이다, 하는 동안 보조 trastuzumab 저항 불가피 하다 제안 했다. 이러한 이유로,이 neoplasia¹⁸의 내부 종양 유전자이 주어진 더욱 문제는 위 암에 HER2 타겟 치료 저항을 일으키는 메커니즘을 명확히 하는 긴급 한 필요가 있다.

또한,의 위 암에 trastuzumab 저항 메커니즘 설명 하 고, 부분적으로 신뢰할 수 있는 전 임상 모델 대표가 조건의 취득에 어려움으로 인해 어려운 입증 했다. 오시마 외 는 vivo에서 선택 방법을 trastuzumab 내성 위 암 세포 선, 작은 잔여 복 막 전이의 반복된 문화 trastuzumab¹⁹치료 후 구성 된의 보고. 그러나, 필요를, 특정 동물 처리 전문, 그리고 동물 윤리 위원회의 승인의 시간 그리고 비용 소모 메서드에 기여. 우리가이 작품에 설명 하는 방법은 간단 하 고 광범위 하 게 적용 이며 다른 종양 histotypes²⁰에서 다른 치료 약물에 저항 메커니즘을 조사 하기 위해 쉽게 확장할 수 있습니다.

Protocol

참고:이 프로토콜은 특별히 조정 되었습니다 그녀의 긍정적인 위 암 세포 선의 trastuzumab 인수 저항을 기본 메커니즘의 분석에 대 한. 필요한 모든 실험실 계기는 자료의 테이블에에서 보고 됩니다. 1입니다. 타겟된 치료 저항 Subclones 세대 참고: 이것은 가장 중요 하 고 어려운 사실은 다른 셀 라인 수 전시 하지 다른 감도 타겟된 치료 억제제를 ?…

Representative Results

그림 1 실험 절차의 프레임 워크를 설명합니다. 3 위 암 세포-라인 HER2 trastuzumab에 민감한의 높은 수준의 표현 (IC50 < 마약, 그림 2A, 왼쪽된 그래프의 피크 플라즈마 수준) 타겟된 치료 에이전트를 포함 하는 문화 매체에서 성장 했다. 복용량은 10 배 trastuzumab (10 µ g/mL)의 피크 플라즈마 농도 시작 하는 복용량으로 설정 되었…

Discussion

맞춤 및 타겟 치료 성장 열정을 elicited 있다, 전통적인 화학 요법 약물, 즉, 약물 내성의 신속 하 고 예측할 수 없는 인수 같은 주요 장애물을 직면 하는이 소위 ‘스마트’ 치료. 타겟된 치료의 결과 개선 하기 위해, 그들을 일으키는 원인이 되는 메커니즘의 더 나은 이해를 통해 약물 저항 문제를 해결 해야 합니다. 여기, 우리는 방법론을 광범위 하 게 액세스할 수 있는 시험관에 암 세포…

Materials

Trizol Reagent	Invitrogen	15596026	TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT	Bio-Rad	1708891	The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR.
TaqMan gene expression assay	Life Technologies	4331182	Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end.
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells.
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates.
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225	The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard.
4x Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	1610747	Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample.
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels	Bio-Rad	456-1094	Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE.
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane.
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots.
Immun-Star WesternC solution	Bio-Rad	5572	Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein.
Universal Negative Control	Invitrogen	12935300	Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology.
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA	Ambion	4390824	RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types.
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778075	Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types.
Mouse anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	working concentration: 1:400 in 5% milk solution
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	working concentration: 1:10000 in 5% milk solution
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase
Thermocycler for RT-PCR	MJ Research	MJ Research PTC-200 Thermal Cycler	it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Real Time RT-PCR instrument	Applied Biosystems	7500 RT-PCR system	This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers
Microvolume Spectrophotometers	Thermo Scientific	Nanodrop	It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample
Blotting system	Bio-Rad	Trans-Blot Turbo system	It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes
Image acquisition system and gel documentation	Bio-Rad	Chemidoc image system	It is easy to use for chemiluminescent detection