यह एक समय है और लागत प्रभावी इन विट्रो प्रोटोकॉल लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों, जो कैंसर प्रबंधन में एक उच्च unmet चिकित्सा की जरूरत है के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के तंत्र की जांच ।
पिछले दो दशकों चिकित्सा ऑन्कोलॉजी में लक्षित चिकित्सा के लिए साइटोटोक्सिक दवाओं से एक बदलाव देखा है. हालांकि लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों और अधिक प्रभावशाली नैदानिक प्रभावकारिता दिखाया गया है और पारंपरिक उपचार से कम प्रतिकूल प्रभाव, दवा प्रतिरोध उनके लाभ के लिए मुख्य सीमा बन गया है । कई इन विट्रो में/ नैदानिक अभ्यास में लक्षित एजेंटों को अधिग्रहण प्रतिरोध के मॉडल में मुख्य रूप से दो रणनीतियों का उपयोग करके विकसित किया गया है: i) अधिग्रहण प्रतिरोध के पादी मॉडलिंग के लिए आनुवंशिक हेरफेर, और द्वितीय) इन विट्रो/ प्रतिरोधी मॉडल के चयन में वीवो । वर्तमान काम में, हम एक एकीकृत ढांचे का प्रस्ताव है, लक्षित चिकित्सीय एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के लिए जिंमेदार अंतर्निहित तंत्र की जांच के लिए, दवा प्रतिरोधी सेलुलर उपक्लोनों के विवरण के लिए पीढ़ी से शुरू मुंह बंद करने प्रक्रियाओं अवरोधक करने के लिए संवेदनशीलता बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया. यह सरल समय और लागत प्रभावी दृष्टिकोण व्यापक रूप से लागू है, और आसानी से विभिन्न ट्यूमर histotypes में अन्य लक्षित चिकित्सकीय दवाओं के लिए प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
आणविक और सेलुलर जीव विज्ञान, उपंयास संश्लेषित विरोधी अणुओं के एक नंबर में महत्वपूर्ण खोजों पर निंनलिखित चुनिंदा ट्यूमर प्रकार की एक व्यापक सरणी में रास्ते संकेत oncogenic लक्ष्य को विकसित किया गया है । विशेष रूप से, कैंसर विज्ञान, अर्थात् सिंथेटिक रासायनिक यौगिकों और रिकॉमबिनेंट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में अद्वितीय गुणों के साथ लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों की दो श्रेणियों, नैदानिक सफलताओं को प्राप्त किया है और नाटकीय रूप हाल के दशकों1,2,3।
फिर भी, उपचार के लिए अपने प्रभावशाली प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बावजूद, कैंसर रोगियों के बहुमत सभी लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों, दोनों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और कळेनासे अवरोधकों के लिए दवा प्रतिरोध विकसित किया है । एक परिणाम के रूप में, दवा प्रतिरोध, क्लासिक विरोधी कैंसर दवाओं के लिए प्रमुख बाधा4, अभी भी उभरते लक्षित चिकित्सा के लिए एक बड़ी चुनौती है5,6।
लक्षित थेरेपी के लिए प्रतिरोध आंतरिक (यानी, प्राथमिक) या (यानी, माध्यमिक) का अधिग्रहण किया जा सकता है । आंतरिक प्रतिरोध चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया के एक de नोवो कमी का वर्णन है, जबकि माध्यमिक प्रतिरोध दवा उपचार7की प्रतिक्रिया की अवधि के बाद होता है । बाद ट्यूमर कोशिकाओं के छोटे साथियों के आदिम ट्यूमर के थोक के भीतर या बाहर की गुप्त संरचनात्मक niches में बसे के प्रकोप के कारण होता है, एक या एक से अधिक लक्षित चिकित्सकीय एजेंटों के लिए ९०% प्रतिरोध करने के लिए प्रदर्शन । आणविक लक्षित चिकित्सा के लिए एक प्रतिरोध विकास अंतर्निहित तंत्र मुख्य रूप से लक्ष्य जीन उत्परिवर्तनों और अन्य समर्थक के निरर्थक सक्रियण से परिणाम अस्तित्व संकेतन रास्ते, जिनकी समझ अभी भी पूरा8से दूर है ।
इस काम में, हम एक समय का प्रस्ताव है और लागत प्रभावी दृष्टिकोण को लक्षित चिकित्सीय एजेंटों के लिए अधिग्रहण प्रतिरोध के विट्रो तंत्र में जांच, मुंह बंद करने के विवरण के लिए दवा प्रतिरोधी सेलुलर उपक्लोनों की पीढ़ी से शुरू अवरोध करनेवाला संवेदनशीलता बहाल करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं, एक महत्वपूर्ण उपकरण के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया और काम कर रहे परिकल्पनाओं मान्य. विशेष रूप से, हमारे दृष्टिकोण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, गैस्ट्रिक कैंसर में, trastuzumab के लिए प्रतिरोध तंत्र (जैसे, Herceptin), एक मानवतावादी मोनोक्लोनल extracellular प्रोटीन के HER2 डोमेन लक्ष्यीकरण एंटीबॉडी9. Trastuzumab + कीमोथेरेपी व्यापक रूप से HER2 पॉजिटिव मेटास्टेटिक स्तन कैंसर के लिए मानक प्रथम पंक्ति उपचार के रूप में स्वीकार कर लिया है । हाल ही में नैदानिक दिखा रहा है कि विरोधी HER2 उपचार दोनों विट्रो में और vivo में HER2-सकारात्मक गैस्ट्रिक कैंसर मॉडल10,11, आणविक ड्रग्स लक्ष्यीकरण HER2 में महत्वपूर्ण गतिविधि है अध्ययन करने के लिए धंयवाद बड़े पैमाने पर नैदानिक परीक्षणों में जांच की, जिनमें से कुछ अभी भी चल रहे हैं, एसिडिटी कैंसर12,13,14,15के साथ रोगियों पर ।
इन अध्ययनों से trastuzumab के लिए प्रतिरोध का सामना कर रहे रोगियों की बढ़ती संख्या पर बल दिया है16, अन्य लक्षित चिकित्सीय अवरोधकों के लिए क्या मनाया जाता है इसी तरह. विशेष रूप से, trastuzumab की प्रतिक्रिया की दर ४७% थी, और trastuzumab पर रोगियों के लिए औसत समग्र अस्तित्व + कीमोथेरेपी केवल २.७ महीने अब कीमोथेरेपी अकेले पर रोगियों के लिए17से अधिक था । यह सुझाव दिया है कि जब प्राथमिक trastuzumab प्रतिरोध प्रचलित है, माध्यमिक trastuzumab प्रतिरोध अपरिहार्य है । इस कारण से, वहां तत्काल HER2 के कारण तंत्र को स्पष्ट करने की जरूरत है गैस्ट्रिक कैंसर में चिकित्सा प्रतिरोध लक्षित है, जो और भी अधिक समस्याग्रस्त इस neoplasia18के अंतर ट्यूमर आनुवंशिक विविधता दिया है ।
इसके अलावा, गैस्ट्रिक कैंसर में trastuzumab प्रतिरोध के तंत्र को समझाने के लिए चुनौतीपूर्ण साबित किया है, आंशिक रूप से इस हालत के विश्वसनीय नैदानिक मॉडल प्रतिनिधि प्राप्त करने में कठिनाई के कारण. ओशिमा एट अल. trastuzumab के साथ उपचार के बाद एक छोटे अवशिष्ट पेरिटोनियल मेटास्टेसिस की एक दोहराया संस्कृति से मिलकर, trastuzumab प्रतिरोधी गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों की vivo चयन विधि में एक की सूचना दी । हालांकि, एक बाड़े की जरूरत है, विशिष्ट पशु हैंडलिंग विशेषज्ञता का, और पशु नैतिकता समिति के अनुमोदन के लिए यह एक समय और लागत लेने वाली विधि बनाने के लिए योगदान दिया । दृष्टिकोण हम इस काम में वर्णन सरल और व्यापक रूप से लागू है, और आसानी से अलग ट्यूमर में अंय चिकित्सीय दवाओं के लिए प्रतिरोध तंत्र की जांच करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है histotypes20।
जबकि व्यक्तिगत और लक्षित चिकित्सा उत्साह बढ़ रही है, इन तथाकथित ‘ स्मार्ट ‘ चिकित्सा पारंपरिक कीमोथेरेपी दवाओं के रूप में ही बड़ी बाधा का सामना, यानी, दवा प्रतिरोध के तेजी से और अप्रत्याशित अधिग्रहण …
The authors have nothing to disclose.
लेखक पांडुलिपि के संपादन के लिए डॉ वेरोनिका Zanoni शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।
Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 | TRIzol Reagent is a reagent for isolating high-quality total RNA or simultaneously isolating RNA, DNA, and protein from a variety of biological samples |
ISCRIPT CDNA SYNTHESIS KIT | Bio-Rad | 1708891 | The iScript cDNA synthesis kit is a sensitive and easy-to-use first-strand cDNA synthesis kit for gene expression analysis using real-time qPCR. |
TaqMan gene expression assay | Life Technologies | 4331182 | Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays consist of a pair of unlabeled PCR primers and a TaqMan probe with an Applied Biosystems FAM or VIC dye label on the 5’ end and minor groove binder (MGB) and nonfluorescent quencher (NFQ) on the 3’ end. |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Thermo Scientific M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent is designed to provide highly efficient total soluble protein extraction from cultured mammalian cells. |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 78440 | Thermo Scientific Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) provides the convenience of a single solution with full protein sample protection for cell and tissue lysates. |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | The Thermo Scientific Pierce BCA Protein Assay Kit is a two-component, high-precision, detergent-compatible assay reagent set to measure (A562nm) total protein concentration compared to a protein standard. |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | Use 4x Laemmli Sample Buffer for preparation of samples for SDS PAGE. For reduction of samples, add a reducing agent such as 2-mercaptoethanol to the buffer prior to mixing with the sample. |
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 456-1094 | Long-life TGX (Tris-Glycine eXtended) Gels have a novel formulation and can be used for both standard denaturing protein separations as well as native electrophoresis. |
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | Bio-Rad | 1610376 | Precision Plus Protein Prestained Standards are available in Dual Color, All Blue, Kaleidoscope, and Dual Xtra formats. All four have the same gel migration patterns, with 3 high-intensity reference bands (25, 50, and 75 kD). |
10x Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 1610732 | 10x Tris/glycine/SDS is a premixed running buffer for separating protein samples by SDS-PAGE. |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | Bio-Rad | 1704156 | Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs for fast, efficient transfer of proteins from mini gels using the Trans-Blot Turbo Transfer System. Each vacuum sealed, ready-to-use transfer pack contains two buffer-saturated ion reservoir stacks and a prewetted PVDF membrane. |
Precision Protein StrepTactin-HRP Conjugate | Bio-Rad | 1610381 | StrepTactin-Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugate for chemiluminescent or colorimetric detection of Precision Plus Protein Unstained Protein Standards or Precision Plus Protein WesternC Protein Standards on western blots. |
Immun-Star WesternC solution | Bio-Rad | 5572 | Immun-Star WesternC solution, a method of protein detection , detects mid-femtogram amounts of protein. |
Universal Negative Control | Invitrogen | 12935300 | Negative Control siRNA has no significant sequence similarity to mouse, rat, or human gene sequences. The control has also been tested in cell-based screens and proven to have no significant effect on cell proliferation, viability, or morphology. |
opti-MEM Glutamax Medium | Thermo Fisher Scientific | 51985026 | Opti-MEM Medium is an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in growth rate or morphology. |
Silencer Select Pre-Designed & Validated siRNA | Ambion | 4390824 | RNA interference (RNAi) is the best way to effectively knock down gene expression to study protein function in a wide range of cell types. |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 13778075 | Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent offers an advanced, efficient solution for siRNA delivery. No other siRNA specific transfection reagent provides such easy and efficient siRNA delivery in a wide variety of cell lines including common cell types, stem cells and primary cells, as well as traditionally hard-to-transfect cell types. |
Mouse anti-IQGAP1 | Invitrigen | 33-8900 | working concentration: 1:400 in 5% milk solution |
goat anti-mouse IgG-HRP: sc-2005 | Santa Cruz | sc-2005 | working concentration: 1:10000 in 5% milk solution |
PMSF | Sigma Aldrich | P 7626 | this is an inhibitor of serine proteases and acetylcholinesterase |
Thermocycler for RT-PCR | MJ Research | MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | it allows temperature homogeneity and a ramping speed of up to 3°C/sec. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
Real Time RT-PCR instrument | Applied Biosystems | 7500 RT-PCR system | This is a five-color platform that uses fluorescence-based polymerase chain reaction (PCR) reagents to provide a relative quantification using comparative CT assay type. The protocol can be performed also with other thermalcyclers |
Microvolume Spectrophotometers | Thermo Scientific | Nanodrop | It provides an accurate and fast acid nucleid measurement using little volume of sample |
Blotting system | Bio-Rad | Trans-Blot Turbo system | It perfoms a semy-dry transfer in a few minutes |
Image acquisition system and gel documentation | Bio-Rad | Chemidoc image system | It is easy to use for chemiluminescent detection |