Ein einfache Fluoreszenz basierende Reporter Assay zelluläre Komponenten identifizieren erforderlich für Ricin Toxin eine Kette (RTA) Handel mit Hefe
Summary
In der Handschrift beschreiben wir die Verwendung eines Hefe-basierte Fluoreszenz Reporter Assays, zelluläre Komponenten des Menschenhandels beteiligt und Tötung Prozesse von der zytotoxischen eine Untereinheit der Pflanze Toxin Rizin (RTA) zu identifizieren.
Abstract
Bakterien- und Werk A / B Toxine nutzen die natürlichen Handel Wege in eukaryotischen Zellen, deren intrazellulären-Zielen in das Zytosol zu erreichen und letztlich töten. Solche A / B Toxine bestehen in der Regel von einer enzymatisch aktive Asubunit (z.B. Ricin Toxin (RTA)) und mindestens eine Zelle, die Bsubunit(s), die verantwortlich sind für Toxin Bindung an bestimmte Oberfläche Rezeptoren Zelle binden. Unseren derzeitigen Kenntnissen wie A / B-Toxine sind in der Lage, effizient berauschenden Zellen half Wissenschaftler um grundlegenden zellulären Mechanismen wie Endozytose und intrazelluläre Protein Sortierung in höhere eukaryotische Zellen zu verstehen. Aus medizinischer Sicht ist es ebenso wichtig, die großen Toxin Handelsrouten, angemessene Behandlungslösungen für Patienten zu finden oder entwickeln schließlich therapeutische Toxin-basierten Anwendungen für die Krebstherapie zu identifizieren.
Seit genomweite Analysen von A / B Toxin in Säugetierzellen Menschenhandel ist komplex, zeitaufwändig und teuer, mehrere Studien an A / B Toxin Transport bei Modellorganismus der Hefe Saccharomyces Cerevisiaedurchgeführt wurden. Obwohl Sie weniger komplex, grundlegende zelluläre Prozesse in Hefe und höhere eukaryotische Zellen sind ähnlich und sehr häufig Ergebnisse, die in der Hefe die Säugetier-Situation übertragbar auf.
Hier beschreiben wir einen schnell und einfach zu bedienen-Reporter Assay zur Analyse der intrazellulären Handel mit RTA in der Hefe. Ein wesentlicher Vorteil des neuen Tests ist die Möglichkeit, nicht nur RTA Retro-Translokation aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) in das Zytosol zu untersuchen, aber eher Endozytose und retrograde Toxin transport von der Plasmamembran in der Notaufnahme. Der Test nutzt ein Reporter Plasmid, die indirekte Messung der RTA Toxizität durch Fluoreszenzemission von das grün fluoreszierende Protein (GFP) kann nach der in-Vivo -Übersetzung. Da RTA effizient die Einleitung der Protein-Biosynthese von 28 s rRNA Depurinierung verhindert, ermöglicht dieser Assay die Identifikation von Host Zellproteinen intrazellulären RTA-Beförderung durch die Erkennung von Veränderungen in Fluoreszenzemission.
Introduction
Patienten mit Infektionen durch Toxin produzierenden Bakterien stellen eine schwere medizinische und finanzielle Belastung für jeden sozialen Gesundheitssystem, insbesondere, da effiziente therapeutische Behandlungen noch weitgehend fehlen. Entwicklung neue therapeutische Strategien, die komplexe Rausch-Mechanismen der medizinisch relevanten A / B Giftstoffe wie Cholera Toxin oder Shiga Toxin Rizin vollständig verstanden werden, auf molekularer Ebene basierend auf neuartige leistungsfähige Assays, die umgesetzt werden müssen.
In den letzten Jahren mehrere Studien versucht, analysieren, A / B Toxin Transport in Hefe und Säugerzellen mit Zeit- und kostenintensive Methoden wie radioaktive Toxin zu beschriften,1,2 sowie SiRNA-basierten Screening 3nähert. In einigen Fällen ist die Toxin Menschenhandel visualisierte in Vivo durch Fluoreszenz-Mikroskopie nach chemische und/oder genetische Kopplung der einzelnen Toxin Untereinheiten mit Fluorophore, Quantenpunkte oder fluoreszierende Proteine4,5gewesen. Leider, solche Änderungen führen oft zu inaktiv und/oder veränderten natürlichen Eigenschaften der Giftstoffe. Eine weitere elegante Möglichkeit, indirekt eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten ist die Verwendung von Reporter-Systeme auf Basis von Enzymen wie LacZ, Luciferase oder fluoreszierende Proteine (z. B. GFP oder Discosoma sp. rot fluoreszierenden Proteins () DsRed)).
In diesem Manuskript ist ein einfaches Protokoll beschrieben die zelluläre Komponenten für den intrazellulären Transport von extrazellulär angewandte RTA in S. Cerevisiaeidentifiziert. Dabei fungiert ein Fluoreszenz-Reporter-Plasmid enthält eine N-terminale ER-Import-Signal gefolgt von GFP als ein Protein-Biosynthese-Sensor, der indirekt RTA-vermittelten Protein Übersetzung Hemmung von GFP Fluoreszenzemission nach in-vivo misst Übersetzung6. RTA Endozytose oder intrazellulären Handel ist negativ (oder positiv) in eine bestimmte Hefe Löschung Mutante im Vergleich zu Wildtyp betroffen, so kann dies durch eine Erhöhung (oder Verringerung) GLP Fluoreszenz Emission6erkannt werden.
Bisher beschränkten sich alle Methoden analysieren RTA Transport in Hefezellen, den ER zum Zytosol Retro-Translokation Prozess der RTA. In solch ein künstliches System drückt sich RTA mit ein ER-Import-Signal von einem induzierbaren Promoter wiederum eine selbstmörderische Phänotyp1,7. Obwohl die Zelle binden B-Untereinheit Ricin ebenfalls in der Versuchsaufbau beschrieben in dieser Handschrift fehlt ist und somit vollständig nicht die natürliche Situation von Ricin Holotoxin Rausch8, Toxin-Transport aus dem Plasma repräsentiert Membran durch den Golgi Apparat in die Notaufnahme kann eng mit dieser neuartigen Assay nachgeahmt werden. Interessanterweise zeigen die vorläufigen Ergebnisse der Pilotstudie, dass die Handel Wege von RTA verwendet auffallende Ähnlichkeiten mit den Rausch-Route von Ricin Holotoxin offenbaren.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann das beschriebene Verfahren verwendet werden, zu bestimmen, die spezifische Rolle der ausgewählten zelluläre Proteine im RTA Endozytose und des Handels in der Hefe. Darüber hinaus könnte diese Versuchsanordnung leicht andere Ribosom Inaktivierung Toxine produziert und abgesondert von verschiedenen Hefen und Bakterien-Spezies wie Zymocin oder Shiga Toxin angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wenn Sie die oben genannten Protokoll durchführen, empfehlen wir die folgenden Vorschläge zu ein erfolgreiches Ergebnis des Experiments zu erreichen.
Für heterologe Proteinexpression ist es wichtig, die IPTG-Konzentration von 1 mM nicht überschreiten. IPTG Konzentrationen > 1 mM zu hemmen, Promotor-induzierte RTA Ausdruck und führen zu geringeren Erträgen Toxin. Darüber hinaus sollten Zellen bei Temperaturen über 28 ° C zur Verhinderung Einbeziehung Körper Bildung, ineffiziente F…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teile dieser Studie wurden freundlicherweise unterstützt durch ein Stipendium der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
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