En enkel fluorescens-baserte Reporter analysen identifisere cellulære komponenter kreves for Risin gift en kjede (RTA) handel med gjær
Summary
I manuskriptet beskriver vi bruk av en gjær-baserte fluorescens reporter analysen identifisere cellulære komponenter involvert i smugling og drepe prosesser av den cytotoksiske en undergruppe til anlegget gift Risin (RTA).
Abstract
Bakteriell og plante A / B giftstoffer utnytte naturlige menneskehandel stier i eukaryote celler å nå deres intracellulær målet (r) i stoffer og til slutt drepe. Slike A / B giftstoffer består vanligvis av en enzymatisk aktive Asubunit (f.eks, Risin gift en (RTA)) og én eller flere celle bindende Bsubunit(s), som er ansvarlig for gift binding til bestemte cellen overflate reseptorer. Vår nåværende kunnskap om hvordan A / B giftstoffer er i stand til å effektivt berusende celler hjalp forskere for å forstå grunnleggende cellulære mekanismer som endocytose og intracellulære protein sortering i høyere eukaryote celler. Fra et medisinsk ståsted er det også viktig å identifisere store gift smuglerrutene finne adekvat behandling løsninger for pasienter eller senere utvikle terapeutiske gift-baserte applikasjoner for kreft terapi.
Siden genomet hele analyser av A / B gift menneskehandel pattedyrceller er komplekse, tidkrevende og kostbare, flere studier på A / B gift transport er utført i gjær modell organismen Saccharomyces cerevisiae. Tross mindre kompleks, grunnleggende cellulære prosesser i gjær og høyere eukaryote celler kan er like og ofte resultatene i gjær overføres til pattedyr situasjonen.
Her beskriver vi en rask og enkel å bruke reporter analysen å analysere intracellulær smugling av RTA i gjær. En viktig fordel med nye analysen er muligheten til å undersøke ikke bare RTA retro-translokasjon fra det endoplasmatiske retikulum (ER) stoffer, men heller endocytose og retrograd gift transportere fra plasma membranen til ER. Analysen gjør bruk av en reporter plasmider der indirekte måling av RTA toksisitet gjennom fluorescens utslipp av grønne fluorescerende protein (GFP) etter i vivo oversettelse. Siden RTA effektivt hindrer oppstart av protein biosyntesen av 28S rRNA depurination, kan denne analysen identifikasjon av verten celle proteiner involvert i intracellulær RTA transport gjennom påvisning av endringer i fluorescens utslipp.
Introduction
Pasienter som lider av infeksjon med toksin-produserende bakterier representerer en alvorlig medisinsk og økonomisk byrde for hver sosiale helsevesenet, spesielt siden effektiv terapeutiske behandlinger er fortsatt i stor grad mangler. Å utvikle nye strategier, komplekse rus mekanismer av medisinsk relevante A / B giftstoffer som kolera gift, Shiga gift eller Risin må være fullt ut forstått på molekylært nivå basert på romanen kraftige analyser som må implementeres.
De siste årene har flere studier forsøkte å analysere A / B gift transport i gjær og pattedyrceller ved hjelp av tid- og kostnadskrevende metoder som radioaktivt gift merking1,2 , samt siRNA-basert screening tilnærminger3. I noen tilfeller har gift menneskehandel vært visualisert i vivo av fluorescens mikroskopi etter kjemiske og/eller genetisk koblingen av personlige gift underenheter med fluorophores, kvante prikker eller fluorescerende proteiner4,5. Dessverre føre slike endringer ofte til inaktive og/eller endrede naturlige egenskaper av giftstoffer. Elegante indirekte svare mange vitenskapelige spørsmål er bruk av reporteren systemer basert på enzymer som lacZ, luciferase eller fluorescerende proteiner (f.eks GFP eller Discosoma sp. røde fluorescerende protein ( dsRed)).
I dette manuskriptet er en enkel protokoll beskrevet som identifiserer cellulære komponenter kreves for intracellulær transport av extracellularly anvendt RTA i S. cerevisiae. Dermed fungerer en fluorescens-reporter plasmider inneholder et N-terminal ER import signal etterfulgt av GFP som en protein biosyntesen sensor, hvilke indirekte måler RTA-mediert protein oversettelsen hemming av GFP fluorescens utslipp etter i vivo oversettelse6. I tilfelle at RTA endocytose og/eller intracellulær handel (positivt eller negativt) påvirkes i en bestemt gjær sletting mutant sammenlignet med vill-type, kan dette være oppdaget gjennom en øke (eller nedgang) i GFP fluorescens utslipp6.
Så langt, var alle metoder analysere RTA transport i gjærceller begrenset til ER-å-stoffer retro-translokasjon prosessen med RTA. En kunstig systemet uttrykkes RTA inneholder et ER import signal fra en induserbart arrangøren som resulterer i en suicidal fenotypen1,7. Selv om cellen bindende B-delenhet i Risin er likeledes mangler i eksperimentell oppsettet beskrevet i dette manuskriptet, og dermed ikke helt representerer den naturlige situasjonen Risin holotoxin rus8, gift transport fra plasma membran gjennom Golgi apparatet til ER kan bli tett etterlignet med denne romanen analysen. Interessant, indikerer de foreløpige resultatene fra pilotstudien at menneskehandel veier brukt av RTA avsløre slående likheter med rus ruten Risin holotoxin.
Oppsummert kan metoden beskrevet brukes til å fastslå den spesifikke-rollen valgte mobilnettet proteiner i RTA endocytose og smugling av gjær. Videre kan eksperimentell installasjonen lett tilpasses andre ribosom inaktivere giftstoffer produsert og skilles ut fra ulike gjær og bakteriell arter som zymocin eller Shiga gift.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du utfører ovenfor protokollen, anbefaler vi følgende forslag å oppnå et vellykket resultat av eksperimentet.
For heterologous protein uttrykk er det viktig å ikke overskride IPTG konsentrasjonen av 1 mM. IPTG konsentrasjoner > 1 mM hemme selskapet-indusert RTA uttrykk og føre til lavere gift gir. Videre være celler ikke dyrket ved temperaturer høyere enn 28 ° C å hindre inkludering kroppen formasjon, ineffektiv bretting og gift inaktivering. RTA uttrykk ved lavere temperatu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deler av denne studien var vennlig støttes av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).
Materials
| Bacterial and yeast strains | |||
| E coli BL21 DE3(Gold) | Aligent Technologies | 230130 | |
| S. cerevisiae BY4742 | Euroscarf | Y10000 | |
| S. cerevisiae BY4742 deletion mutants | Dharmacon | YSC1054 | whole collection |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids used in this protocol | |||
| pET24a(+) (Novagen) | Millipore | 69772-3 | |
| pET-RTA(His6) | Becker et al. (2016)3 | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Zymolyase 20T | USBio | Z1000.250 | lytic enzyme for cell wall removal |
| LB broth medium | Thermo Scientific | 10855021 | 15 g agar was added for plate production |
| YNB | Thermo Scientific | DF0335-15-9 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Yeast drop-out mix supplemts without leucine | Sigma-Aldrich | Y1376-20G | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 05040-100G | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| D-raffinose | Sigma-Aldrich | 83400-25G | |
| D-sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-1KG | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750-10MG | |
| G418 | Thermo Scientific | 11811031 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Imidazole | Roth | 3899.1 | |
| PAGE ruler prestained | Fermentas | 26616 | protein ladder used for Western analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material for RTA purification, desalting and reader measurements | |||
| Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro | Amersham | ||
| Soniprep 150 | MSE | old model, other models available | |
| Fluoroskan Ascent | Thermo Scientific | 5210470 | old model, not available anymore |
| ÄKTAPurifier | Thermo Scientific | 28406266 | Product is discontinued and replaced |
| HisTRAP HP column | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| HiTRAP desalting column | GE Healthcare | 11-0003-29 | |
| Midisart sterile filter | Sartorius | 16534K | 0.2 µm pore size |
| BCA protein assay kit | Pierce | 23225 | |
| 660 nm assay kit | Thermo Scientific | 22660 | |
| 96 well plates | Thermo Scientific | 260860 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies (optional) | |||
| Anti-Tetra-His | Qiagen | 34670 | primary antibody; 1:1,000 dilution |
| Anti-mouse-HRP | Sigma-Aldrich | A9044-2ML | secondary antibody, 1:10,000 dilution |
References
- Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
- Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119 (2012).
- Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
- Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
- Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
- Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
- Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
- Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
- Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
- Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
- Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
- Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
- Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).
