Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation
Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la culture 3D du rat encéphales gliales, y compris les astrocytes, la microglie et les oligodendrocytes. Nous démontrons la culture cellulaire primaire, synthèse de l’acide hyaluronique methacrylated (HAMA) hydrogel, HAMAphoto-polymérisation et le cell encapsulation et traitement d’imagerie microscopique confocal et balayage électronique des échantillons.
Abstract
Dans le système nerveux central, nombreuses lésions aiguës et les maladies neurodégénératives, ainsi aussi implanté des dispositifs ou des biomatériaux conçus pour améliorer le résultat de la fonction dans le même résultat : inflammation excès conduit à une gliose, cytotoxicité, et/ou formation d’une cicatrice gliale qui collectivement aggraver une atteinte ou d’empêcher la reprise saine. Dans le but de créer un système de modèle cicatrice gliale formation et l’étude des processus inflammatoires, nous avons généré un échafaudage de cellule 3D capable d’accueillir des cellules gliales cultivés primaires : microglie qui régulent la réponse du corps étranger et initient la événement inflammatoire, astrocytes qui réagissent pour former une cicatrice fibreuse et oligodendrocytes qui sont en général vulnérables aux lésions inflammatoires. Le présent ouvrage offre une méthode détaillée étape par étape pour la fabrication, la culture et caractérisation microscopique d’un échafaudage d’hydrogel 3D à base d’acide hyaluronique avec rat encapsulé encéphales de cellules gliales. En outre, les protocoles pour la caractérisation d’encapsulation de cellules et de l’échafaud hydrogel par immunofluorescence confocale et microscopie électronique à balayage sont démontrés, ainsi que la capacité de modifier l’échafaud avec des substrats bioactifs, avec incorporation d’un mélange commercial de lame basale d’intégration améliorée de cell.
Introduction
L’inflammation du système nerveux central (CNS) a longtemps été considérée comme une caractéristique de l’aigu (par exemple, accident vasculaire cérébral ischémique, traumatisme cérébral et la moelle épinière) et chroniques (p. ex. Alzheimer, Parkinson d’et maladies de la chorée de Huntington) lésion de CNS, mais n’est plus en plus reconnue comme un facteur causal de neurodégénératives et des troubles neuropsychiatriques. Maintenue ou inflammation inappropriée peut causer des blessures neurales et démyélinisation (p. ex. sclérose en plaques) et une influence négative sur le développement du cerveau (par exemple, la schizophrénie, l’autisme) et des États de l’humeur (p. ex., dépression, anxiété le trouble bipolaire). En outre, de nouvelles stratégies thérapeutiques à l’aide de dispositifs implantables (e.g., interfaces cerveau-ordinateur1,2,3, deep brain stimulation4,5, intraspinale microstimulation6,7,8,9,10) générer une réponse inflammatoire prévisible à l’interface entre l’appareil et le système nerveux central, entraînant une réponse de tissu protecteur qui peut provoquer une perte d’efficacité ou dispositif échec au cours de la durée de vie de l’ implant11. L’inflammation dans le système nerveux central est généralement initiée par la microglie, qui fonctionnent comme les cellules immunitaires résidents du CNS, responsable de la surveillance des tissus et la réaction au corps étranger (révisé12) de montage. Selon la gravité de l’insulte, le signal de la microglie et les recrues supplémentaires types de cellules à un site de la lésion. Plus précisément, les cellules microgliales activer les astrocytes, qui à leur tour agissent comme des cellules inflammatoires secondaires et forme une barrière protectrice dense pour contenir une blessure site13,14. Microglies peuvent aussi initier une cascade d’activité dans les cellules du système immunitaire périphérique, ce qui peut entraîner la rupture de la BHE afin de permettre l’infiltration immunitaire (revue en référence15).
Dans le cas des dispositifs implantés dans le SNC, les lésions tissulaires résultant d’un dispositif ainsi que la présence continue de l’appareil étranger peuvent enclencher un processus appelé la cicatrice gliale. Dans ce processus, les cellules microgliales migrent vers et se multiplient à l’endroit de la blessure. Ils ont également l’initiative la libération de facteurs inflammatoires pour neutraliser les menaces potentielles et recruter des cellules gliales supplémentaires. Par la suite, astrocytes activés deviennent hypertrophiques et commencent à encapsuler le dispositif implanté pour former une barrière fibreuse continue16. Signalisation inflammatoires sert également à promouvoir le retrait des processus neuronaux de la proximité de l’implant et finalement recrute des fibroblastes pour renforcer le développement de la cicatrice gliale17. Les oligodendrocytes, responsables de gainage des neurones dans la myéline pour améliorer la conductance, ne survivent pas à ce processus et cellules éloignés sont séparés de l’implant par la cicatrice18. Cicatrice gliale grandement réduit la fonction et la durée de vie des dispositifs implantés, notamment pour les électrodes d’enregistrement et en fin de compte sert à limiter les fonctionnalités des interfaces neuronales19.
Plusieurs approches ont été exploités pour augmenter la biocompatibilité et une activité d’interface des dispositifs implantés dans les CNS20,21,22,23. Un examen exhaustif est disponible sur la conception biocompatible de ces interfaces neurales24. Les principales stratégies incluent entourant l’électrode avec revêtements compatibles tels que polyelthyleneglycol (PEG), acides polylactique-co-glycolique (PLGA)25, ou le renforcement de l’électrode avec des polymères conducteurs tels que poly (éthylène dioxythiophene) (PEDOT) et le polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Revêtements bioactifs ont également été employées pour offrir des repères pour la croissance de tissu nerveux à l’aide de ligands dérivés de matrices extracellulaires notamment collagènes et fibronectins des acides hyaluroniques32,33,34 ,35,36,37. La bioactivité de ces revêtements a été approfondie avec facteur de croissance des systèmes de largage d’émuler cellulaire naturel des sécrétions30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. en même temps, certains groupes de recherche ont opté pour transformer la géométrie de l’électrode, la flexibilité et composition pour diminuer le décalage mécanique entre l’appareil et les tissus51,52,53 ,,du5455,56,,57. Au total, ces stratégies ont entraîné de nombreuses améliorations prometteuses de génération neurones périphériques interfaciales, cependant la compatibilité à long terme est une question de cours et de progrès peuvent être entravé par des modèles complexes et fastidieuses in vivo .
Des approches basées sur le modèle animales peuvent limiter le débit expérimental et augmentent les coûts des tests de biocompatibilité de l’électrode. In vitro les approches à l’aide de culture de cellules classiques techniques offrent une alternative plus rentable, mais ne parviennent pas à une grande partie de la complexité de l’interaction entre l’appareil et les tissus58récapituler. En particulier, essais des revêtements de surface à l’aide de limites de culture cellulaire 2D, la modélisation de la géométrie de l’électrode et l’influence de décalage mécanique et micromotion considéré à générer une réponse de l’hôte qui contribuent au dispositif échec59 , 60.
Pour surmonter les problèmes liés à la culture cellulaire 2D, hydrogel de cultures de cellules nerveuses ont été développés pour une grande variété d’applications, les études pharmacologiques61, pour diriger la différenciation des cellules neurales62, pour comprendre la maladie les voies63,64, ou en couches en culture mixte avec d’autres types de cellules pour la migration de modèle cellulaire, neuroprotection, ou modèle tissu microenvironnements61. Hydrogels sont facilement formés à différentes dimensions et géométries peuvent incorporer de nombreux types de cultures de cellules primaires ou immortalisé et sont très propices à l’analyse de techniques couramment utilisées, telles que la microscopie confocal fluorescence. Pour créer un modèle du processus de cicatrisation glial, nous avons récemment développé et caractérisé un système acide hyaluronique base hydrogel 3D haut débit stable de la réaction gliale à implanté des électrodes (Figure 1)65. Ce système a plusieurs avantages distincts : 1) primaires cellules gliales (cellules microgliales, astrocytes et oligodendrocytes) sont encapsulées dans une matrice 3D composée de polymères d’acide hyaluronique, qui est un composant de la matrice extracellulaire endogène ; 2) la rigidité de la matrice peut être « réglée » pour recréer les propriétés mécaniques du cerveau ou des tissus de la moelle épinière ; et 3) des cellules peuvent être encapsulés dans la matrice dans une approche rapide de la table à l’aide de photopolymérisation avec feu vert, limiter la toxicité au cours de l’encapsulation. Ce système permet aux fonctionnalités clés dans vivo biocompatibilité : dispositifs sont insérées dans l’hydrogel de manière comparable aux tissus, et la réponse cellulaire aux dispositifs implantés sont surveillés pour un large éventail de paramètres65. Il s’agit d’une incompatibilité mécanique entre les périphériques et les revêtements d’hydrogel de diverses structures et les impulsions de stimulation électrique. Ce système comprend également des oligodendrocytes et des précurseurs connexes, qui sont souvent présents et recruté des cicatrices gliales. Leurs dégâts, la mort et la phagocytose par les cellules microgliales sont très révélateurs de lésion inflammatoire et comme un modèle réduit de cicatrices ou récupération, ils ont la capacité de démontrer re-myélinisation des neurones66.
Dans les présentes, nous décrivons une méthode de synthèse et de la formation d’hybrides acide hyaluronique hydrogels combinées avec des formulations de membrane de sous-sol disponible dans le commerce pour améliorer la Constitution de la cellule. En outre, nous allons démontrer l’intégration de primaire des cellules gliales (microglie, astrocytes et oligodendrocytes) et analyse de la croissance de la culture en utilisant l’immunocytochimie et microscopie confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif de générer un système de culture 3D pour modèle bioreactivity gliales et le processus de cicatrisation glial, nous avons développé un système qui peut prendre en charge primaire des microglies culture, astrocytes et oligodendrocytes et permet la caractérisation robuste de cellule interactions cellule-cellule et de la morphologie. De la microscopie montré, la morphologie de chaque type de cellule a été distinctement différente avec plates-formes mélange 2D, 3D-HAMA et 3D lamina HAMA-basale. Dans …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants pour le soutien financier du CRSNG, FCI, AIHS, Alberta Health Services et la dotation de Davey pour la recherche sur le cerveau.
Materials
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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