Burada, biz fare 3D kültür için bir protokol beyin kaynaklı glia hücreleri, astrocytes, microglia ve oligodendrocytes de dahil olmak üzere mevcut. Biz birincil hücre kültürü, methacrylated hyaluronik asit (HAMA) hidrojel sentezi, HAMAphoto polimerizasyon ve hücre saklamasını ve confocal ve tarama elektron mikroskobik görüntüleme için işleme örnek göstermektedir.
Merkezi sinir sistemi, çok sayıda akut yaralanmalar ve nörodejeneratif hastalıklar, de yerleştirilmiş cihazlar veya Biyomalzeme mühendislik işlevi sonuç aynı sonucu geliştirmek için: aşırı iltihap gliosis, sitotoksisite, yol açar ve/veya topluca yaralanma azdırmak veya sağlıklı kurtarma engelleyen bir gliyal yara oluşumu. Bir sistem modeli gliyal yara oluşumu ve çalışma inflamatuar işlemlere oluşturma niyetiyle, bir 3D cep iskele birincil kültürlü gliyal hücreler muhafazasında üretilip: yabancı cisim yanıt düzenleyen ve başlatmak microglia inflamatuvar olay, fibröz skar oluşturmak için yanıt astrocytes ve inflamatuar yaralanma genellikle açık olan oligodendrocytes. Mevcut çalışma gliyal hücreler beyin kaynaklı imalat, kültür ve hyaluronik asit tabanlı 3D hidrojel iskele kapsüllenmiş fare ile mikroskopik karakterizasyonu için detaylı bir adım-adım yöntemi sağlar. Ayrıca, hücre saklama ve hidrojel iskele confocal ayirt ve elektron mikroskobu tarama tarafından karakterizasyonu protokollerde, yanı sıra ile iskele biyoaktif yüzeylerde ile değiştirmek için kapasite içinde gösterilen Gelişmiş hücre Tümleştirme ticari Bazal lamina karışıma birleşme.
Merkezi sinir sistemi (MSS) iltihabı uzun akut damgasını kabul (örneğin, iskemik inme, travmatik beyin ve omurilik yaralanma) ve kronik (örneğin Alzheimer, Parkinson’ın ve Huntington hastalıkları) CNS yaralanma, Ama giderek nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozukluklar için nedensel bir katkı olarak kabul edilmektedir. Sürekli veya uygunsuz inflamasyon, sinir hasarı ve demiyelinizasyon (örneğin multipl skleroz) neden ve olumsuz etkisi beyin gelişimi (örneğin, şizofreni, otizm) ve ruh Birleşik (örneğin, depresyon, anksiyete bipolar bozukluk). , Daha fazla implante edilebilir cihazlar kullanarak yeni tedavi stratejileri (örn., beyin-bilgisayar-arabirimleri1,2,3, derin beyin stimülasyonu4,5, kesici microstimulation6,7,8,9,10) aygıt ve sonuçlanan CNS arasında arayüz, tahmin edilebilir bir enflamatuar yanıt oluşturmak bir koruyucu doku yanıt implant11ömrü boyunca etkinlik ya da aygıt hatası kaybına neden olabilir. MSS iltihap genellikle hangi doku gözetim ve yabancı cisim yanıt (gözden geçirilmiş12) Montaj sorumlu CNS yerleşik bağışıklık hücreleri olarak işlev microglia tarafından başlatılır. Bir hakaret şiddetine bağlı olarak, hücre microglia sinyal ve işe ek türleri bir yaralanma sitesine. Özellikle, microglia sırayla ikincil inflamatuar hücreler ve form bir yaralanma sitesi13,14içerecek şekilde yoğun bir koruyucu bariyer olarak hareket astrocytes etkinleştirin. Microglia de bir aktivite cascade periferik bağışıklık sistemi, bağışıklık infiltrasyon (başvuru15dakika içinde gözden) izin vermek için BBB arıza neden olabilir hücrelerdeki başlatabilir.
Aletler MSS söz konusu olduğunda, aygıt ekleme yanı sıra yabancı aygıt devam eden varlığı ortaya çıkan doku hasarı gliyal skarlasma olarak adlandırdığı bir işlem başlatabilir. Bu süreçte microglia göç ve yaralanma sitesinde çoğalırlar. Onlar da serbest bırakılması inflamatuar amil-e doğru potansiyel tehditleri etkisiz hale getirmek ve ek gliyal hücreler işe başlatın. Daha sonra aktif astrocytes Hipertrofik olmak ve sürekli lifli bariyer16oluşturmak için implante cihazın Kapsüllenen başlar. İnflamatuar sinyalizasyon da implant çevresinde nöronal işlemleri geri çekilmesi teşvik için hizmet vermektedir ve sonunda fibroblastlar gelişmekte olan gliyal yara17güçlendirmek için acemi. Gürültülerinden, geliştirmek için miyelin nöronlarda kaplama için sorumlu oligodendrocytes bu işlem hayatta yapmak ve uzak hücreler yara18tarafından implant bölümlendirilir. Büyük ölçüde gliyal skarlasma işlevi ve boyu implant cihazları, özellikle kayıt elektrotları, azaltır ve sonuçta Sinirsel arayüzleri19işlevselliği sınırlamaya yönelik hizmet vermektedir.
Birkaç yaklaşım Biyouyumluluk ve CNS20,21,22,23implant cihazlarının arabirimi etkinliği artırmak için istismar. Kapsamlı bir inceleme bu Sinirsel arayüzleri24Biyouyumlu tasarım üzerinde kullanılabilir. Polyelthyleneglycol (PEG), polylactic-co-glikolik asit (PLGA)25, gibi uyumlu kaplamalar ile elektrodu çevreleyen veya elektrot Poli (etilen gibi iletken polimerler ile arttırmak en önemli stratejileri içerir dioxythiophene) (PEDOT) ve polypyrrole (PPy)26,27,28,29,30,31. Biyoaktif kaplamalar da collagens, fibronectins ve hyaluronik asit32,33,34 de dahil olmak üzere hücre dışı matrisler türetilmiş ligandlar kullanarak sinir dokusu büyüme için yardım sağlamak için istihdam edilmiştir ,35,36,37. Bu kaplama bioactivity daha fazla büyüme faktörü yayın sistemleri ile doğal hücre salgıları30,38,39,40,41 taklit etmek için araştırdı , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. aynı anda, bazı araştırma grupları elektrot geometri, esneklik ve kompozisyon aygıt ve doku51,52,53 arasında mekanik uyumsuzluk azaltmak için yeni model için seçtiniz ,54,55,56,57. Tamamen, bu stratejileri çok umut verici gelişmeler için kurşun nesil sinirsel interfacial içinde ancak uzun vadeli uyumluluk bir devam konudur ve ilerleme karmaşık ve zaman alıcı içinde vivo modelleri tarafından engel aygıtlarınızda .
Hayvan modeli tabanlı yaklaşımlar deneysel işlem hacmi sınırlamak ve elektrot Biyouyumluluk test maliyetleri artırmak. Vitro geleneksel hücre kültürü teknikleri daha düşük maliyetli bir alternatif teklif ama aygıt ve doku58arasındaki etkileşimi karmaşıklık çoğunu özetlemek başarısız kullanarak yaklaşıyor. Özellikle, yüzey kaplama elektrot geometri modellenmesi ve mekanik uyuşmazlığı ve aygıt hatası59 için katkıda bulunan bir ana bilgisayar yanıt üretme için katkıda bulunmak için düşündüm micromotion etkisi 2D hücre kültürü sınırları kullanarak sınama , 60.
2D hücre kültürü ile ilişkili sorunların üstesinden gelmek için sinir hücreleri kültürleri hidrojel çok çeşitli uygulamalar, farmakolojik çalışmalar61, hastalığı anlamak için sinir hücre farklılaşması62, yönlendirmek için geliştirilmiştir yollar63,64veya diğer hücre tipleri modeli hücre geçiş, neuroprotection, veya modeli doku microenvironments61ile içinde katmanlı Co kültür. Hydrogels farklı boyutlarda kolayca kurulur ve geometriler birincil veya ölümsüzleştirdi hücre kültürleri çeşitli tiplerde dahil edebilirsiniz ve son derece confocal floresan mikroskopisi gibi yaygın olarak kullanılan teknikleri göre analiz için mükellef bulunmaktadır. Gliyal skarlasma sürecinin bir model oluşturmak için biz son zamanlarda geliştirilen ve hyaluronik asit tabanlı 3D hidrojel sistem yüksek üretilen iş için implante elektrotlar (şekil 1)65gliyal yanıt test etmek için karakterize. Bu sistem birçok farklı avantajı vardır: 1) birincil gliyal hücreler (microglia, astrocytes ve oligodendrocytes) bir endojen hücre dışı matriks bileşenidir; hyaluronik asit polimerleri oluşan bir 3D matris içinde kapsüllü 2) matris sertlik ‘ beyin ya da omurilik doku mekanik özelliklerini yeniden oluşturmak için ayarlanan’; ve 3) hücreleri ile yeşil ışık, toksisite sarma sırasında sınırlama photopolymerization kullanarak hızlı bir tezgah üstü yaklaşım matris içinde kapsüllenir. Anahtar şekil-in vivo Biyouyumluluk bu sistemi sağlar: cihazlar doku karşılaştırılabilir şekilde hidrojel eklenen ve yerleştirilmiş cihazlar hücresel yanıt parametreleri65geniş bir yelpazesi için izlenir. Bu cihazlar ve çeşitli yapıları ve elektrik stimülasyon bakliyat hidrojel kaplamalar arasında mekanik uyuşmazlığı içerir. Bu sistem de oligodendrocyte ve çoğu kez mevcut ve gliyal izleri işe ilgili precursors içerir. Onların hasar, ölüm ve fagositoz microglia tarafından son derece tahrik edici yaralanma işaret etmektedir ve skarlasma veya kurtarma manken azaltılmış gibi onlar re-myelination nöronlar66göstermek için kapasitesine sahip.
Burada sentez ve hücre birleşme geliştirmek için piyasada bulunan membran formülasyonları ile kombine hibrid hyaluronik asit hydrogels oluşumu için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, biz birincil kültürlü gliyal hücreler (microglia, astrocytes ve oligodendrocytes) birleşme ve kültür büyüme immunocytochemistry ve confocal mikroskobu kullanarak analizini gösterecektir.
Modeli gliyal bioreactivity 3D kültür sisteme ve gliyal skarlasma işlemi üreten hedefe doğru biz birincil kültürlü microglia, astrocytes ve oligodendrocytes destekleyebilir ve sağlam hücre karakterizasyonu sağlayan bir sistem geliştirdik morfoloji ve hücre-hücre etkileşimler. Gösterilen Filmler her hücre türünün morfolojisi 2D, 3D-HAMA ve 3D HAMA Bazal lamina karışımı platformları ile belirgin farklı. 2D sistem Morfoloji belirgin yüzey düzlemde önyargılı ama 3D HAMA karşılaştırıldığ?…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar için finansal destek NSERC, CFI, AIHS, Alberta sağlık hizmetleri ve Davey bağış beyin araştırmaları için minnettarız.
1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |