Migliorata 3D idrogel culture di cellule gliali primari In Vitro modellazione del Neuroinflammation
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la cultura 3D del ratto cellule di glia cervello-derivato, tra cui gli astrociti, microglia ed oligodendrociti. Dimostriamo che la cellula primaria cultura, sintesi di idrogel di acido ialuronico methacrylated (HAMA), incapsulamento delle cellule e HAMAphoto-polimerizzazione e campione di elaborazione per l’imaging al microscopio confocale e scansione elettrone.
Abstract
Nel sistema nervoso centrale, numerose lesioni acute e malattie neurodegenerative, come bene come impiantati dispositivi o biomateriali ingegnerizzati per migliorare il risultato della funzione allo stesso risultato: l’infiammazione in eccesso conduce a gliosi, citotossicità, e/o Formazione di una cicatrice gliale che collettivamente aggravare lesioni o impedire il ripristino sano. Con l’intento di creare un sistema di modello cicatrice gliale formazione e studio dei processi infiammatori, abbiamo generato un’impalcatura di cella 3D in grado di ospitare le cellule gliale coltivate primarie: microglia che regolano la reazione da corpo estraneo e avviare la evento infiammatorio, astrociti che rispondere a formare una cicatrice fibrosa e oligodendrociti che sono in genere vulnerabili al danno infiammatorio. Il presente lavoro fornisce un metodo passo passo dettagliato per la fabbricazione, la cultura e la caratterizzazione microscopica di un ponteggio di idrogel 3D a base di acido ialuronico con ratto incapsulato cervello-ha derivato le cellule gliali. Ulteriormente, vengono illustrati i protocolli per la caratterizzazione di incapsulamento delle cellule e l’impalcatura di idrogel di immunofluorescenza confocale e microscopia elettronica a scansione, così come la capacità di modificare il patibolo con substrati bioattivi, con incorporazione di una miscela commerciale lamina basale all’integrazione migliore delle cellule.
Introduction
Infiammazione del sistema nervoso centrale (CNS) lungamente è stato considerato un segno distintivo di acuto (ad es., ictus ischemico, trauma cerebrale e ferita del midollo spinale) e croniche (ad es. morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson di e malattie di Huntington) lesione dello SNC, ma è sempre più riconosciuto come un contributo causale alla malattie neurodegenerative e disordini neuropsichiatrici. Sostenuto o infiammazione inappropriato può causare lesioni neurali e demielinizzazione (ad es. sclerosi multipla) e influenzare negativamente lo sviluppo del cervello (ad esempio, la schizofrenia, autismo) e Stati dell’umore (per esempio, depressione, ansia disturbo bipolare). Inoltre, nuove strategie terapeutiche utilizzando dispositivi impiantabili (ad es., interfacce cervello-computer1,2,3, cerebrale profonda stimolazione4,5, intraspinal microstimulation6,7,8,9,10) generare una risposta infiammatoria prevedibile all’interfaccia tra il dispositivo e il sistema nervoso centrale con conseguente un risposta di tessuto protettivo che può causare la perdita di efficacia o dispositivo guasto per tutta la durata dell’ impianto11. Infiammazione del SNC viene in genere avviato da microglia, che fungono da cellule immunitarie residente dello SNC responsabili della sorveglianza del tessuto e la risposta da corpo estraneo (ha commentato12) di montaggio. A seconda della gravità dell’insulto, il segnale di microglia e recluta ulteriore tipi a un sito di lesione delle cellule. In particolare, le microglia attivate gli astrociti, che a loro volta fungono da cellule infiammatorie secondarie e forma una barriera protettiva densa per contenere un infortunio sito13,14. Le microglia possono inoltre avviare una cascata di attività nelle cellule del sistema immunitario periferico, che può provocare la rottura della barriera emato-encefalica per permettere l’infiltrazione immune (rivisto in riferimento15).
Nel caso di dispositivi impiantati nello SNC, danni ai tessuti derivanti dall’inserimento del dispositivo, nonché la continua presenza del dispositivo straniero possono avviare un processo chiamato cicatrici gliali. In questo processo, la microglia migrare e proliferare il sito della lesione. Iniziano anche il rilascio di fattori infiammatori per neutralizzare le minacce potenziali e reclutare altre cellule gliali. Successivamente, gli astrociti attivati diventano ipertrofici e iniziano che incapsula il dispositivo impiantato per formare una barriera fibrosa continua16. Infiammatorie di segnalazione serve anche a promuovere il ritiro di processi neuronali dalle vicinanze dell’impianto e alla fine reclute fibroblasti per rinforzare la cicatrice gliale sviluppo17. I oligodendrocytes, responsabili di guaina neuroni nella mielina per migliorare la conduttanza, non sopravvivono questo processo e cellule distanti sono divisi dall’impianto di cicatrice18. Cicatrici gliali notevolmente riduce la funzione e la durata dei dispositivi impiantati, particolarmente per gli elettrodi di registrazione e in definitiva serve a limitare la funzionalità di interfacce neurali19.
Diversi approcci sono stati sfruttati per aumentare la biocompatibilità e l’attività di interfaccia dei dispositivi impiantati nel CNS20,21,22,23. Una vasta revisione è disponibile sulla progettazione biocompatibile di queste interfacce neurali24. Le strategie più prominenti includono che circonda l’elettrodo con rivestimenti compatibili come polyelthyleneglycol (PEG), acidi polilattico-co-glicolico (PLGA)25, o migliorando l’elettrodo con polimeri conduttivi come poli (etilene dioxythiophene) (PEDOT) e polipirrolo (PPy)26,27,28,29,30,31. Rivestimenti bioattivi sono stati impiegati anche per fornire spunti per la crescita di tessuto neurale utilizzando ligandi derivati da matrici extracellulari inclusi collageni, fibronectins e acidi ialuronici32,33,34 ,35,36,37. La bioattività di questi rivestimenti è stato ulteriormente esplorata con sistemi di rilascio di fattore di crescita per emulare la cellula naturale secrezioni30,38,39,40,41 , 42 , 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50. contemporaneamente, alcuni gruppi di ricerca hanno optato per rimodellare la geometria dell’elettrodo, la flessibilità e la composizione per diminuire la meccanica mancata corrispondenza tra il dispositivo e tessuto51,52,53 ,54,55,56,57. Complessivamente, queste strategie hanno portato a molti promettenti miglioramenti nell’interfacciale neurale, dispositivi di prossima generazione, tuttavia la compatibilità a lungo termine è un problema in corso e progresso può essere ostacolata da lunghi e complessi in vivo modelli .
Gli approcci basati su modello animali possono limitare la velocità di trasmissione sperimentale e aumentare i costi delle prove di biocompatibilità di elettrodo. In vitro si avvicina utilizzando colture cellulari convenzionali tecniche offrono un’alternativa più economica ma non riescono a ricapitolare la complessità dell’interazione tra il dispositivo e tessuto58. In particolare, test dei rivestimenti superficiali utilizzando limiti di cultura cellulare 2D alla modellazione della geometria dell’elettrodo e l’influenza di mancata corrispondenza meccanica e micromotion pensati per contribuire a generare una risposta di host contribuendo al dispositivo guasto59 , 60.
Per superare i problemi associati con coltura cellulare 2D, idrogel culture di cellule neurali sono state sviluppate per una vasta gamma di applicazioni, studi farmacologici61, per dirigere la differenziazione delle cellule neurali62, per capire la malattia percorsi63,64, o a strati in co-coltura con altri tipi di cellule per migrazione delle cellule di modello, neuroprotezione, o modello tessuto microambienti61. Idrogeli si formano facilmente alle diverse dimensioni e geometrie possono incorporare numerosi tipi di colture cellulari primarie o immortalizzate e sono altamente suscettibili di analisi di tecniche comunemente usate come microscopia di fluorescenza confocale. Per creare un modello del processo di cicatrici gliale, abbiamo recentemente sviluppato e caratterizzato un sistema idrogel 3D base di acido ialuronico per high throughput test della risposta gliale a elettrodi impiantati (Figura 1)65. Questo sistema ha diversi vantaggi: 1) primarie cellule gliali (microglia, astrociti e oligodendrociti) vengono incapsulate in una matrice 3D composta da polimeri di acido ialuronico, che è un componente della matrice extracellulare endogeno; 2) la rigidità di matrice può essere ‘sintonizzata’ per ricreare le caratteristiche meccaniche del cervello o del midollo spinale del tessuto; e 3) le cellule possono essere incapsulate nella matrice in un approccio di banco rapido utilizzo di fotopolimerizzazione con luce verde, limitazione della tossicità durante l’incapsulamento. Questo sistema permette le caratteristiche principali di biocompatibilità in vivo : dispositivi vengono inseriti nell’idrogel in maniera analoga al tessuto, e la risposta cellulare a dispositivi impiantati sono monitorati per una vasta gamma di parametri65. Questi includono meccanica mancata corrispondenza tra i dispositivi e i rivestimenti di idrogel di varie strutture e impulsi di stimolazione elettrica. Questo sistema include anche oligodendrociti e precursori correlati, che sono spesso presenti e reclutati in cicatrici gliali. Loro danno, la morte e la fagocitosi di microglia sono altamente indicativi di lesioni infiammatorie e come un modello ridotto cicatrici o recupero, hanno la capacità di dimostrare re-mielinizzazione dei neuroni66.
Qui descriviamo un metodo per la sintesi e formazione di idrogel di acido ialuronico ibrido combinato con formulazioni disponibili in commercio della membrana dello scantinato per migliorare l’incorporazione delle cellule. Ulteriormente, ci dimostrerà l’incorporazione delle cellule gliale coltivate primarie (microglia, astrociti e oligodendrociti) e analisi della crescita cultura mediante immunoistochimica e microscopia confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verso l’obiettivo di generare un sistema di coltura 3D per modello glial bioreactivity e il processo di cicatrizzazione glial, abbiamo sviluppato un sistema che può supportare primaria microglia coltivate, astrociti e oligodendrociti e consente la robusta caratterizzazione della cella interazioni cellula-cellula e morfologia. Da micrografie mostrati, la morfologia di ogni tipo di cellula era distintamente differente con piattaforme di miscela della lamina basale HAMA 2D, 3D-HAMA e 3D. Nel sistema 2D, morfologia era deci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati per il sostegno finanziario da NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services e la dotazione di Davey per ricerca del cervello.
Materials
| 1. Materials for HAMA synthesis and photopolymerization | |||
| Hyaluronic acid (HA) | Sigma-Aldrich | 53747-10G | Streptococcus equi, MW: 1.5 – 1.8 X 10^6 |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 275585-100ML | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| Ethanol (EtOH) | Commerical Alcohols Inc. | Anhydrous | |
| Phosphate buffered saline (pH 7.4) tablets | Fisher Scientific | 18912014 | |
| Triethanolamine (TEA) | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| 1-Vinyl-2pyrrolidinone (NVP) | Sigma-Aldrich | V3409-5G | |
| EosinY (EY) | Sigma-Aldrich | E6003-25G | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 440159-100ML | |
| Beaker (100 mL) | Corning | 1000-100 | |
| Beaker (500 mL) | Corning | 1000-600 | |
| pH paper (Labstick) | Sigma-Aldrich | 9580 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Materials for glial cell isolation and cell culture | |||
| P1-2 Sprague Dawley rat pups | Charles River | CD Sprague Dawley rat strain code 001 | |
| Dissector scissors – slim blades (small) | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Surgical scissors – Toughcut (large) | Fine Science Tools | 14130-17 | |
| Fine forceps (Dumont #5) | Fine Science Tools | 11521-10 | |
| Curved fine forceps (Dumont #7) | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Hank's balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14170-112 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 11320-033 | |
| Penicillin-streptomycin (PS) | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 12483-020 | |
| 0.25% Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Gibco | 25200-072 | |
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P-6282 | |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 05-539-5 | |
| 12 well Tissue culture treated plates (Cellstar) | Greiner Bio-One | 665 108 | |
| 10 mL serological pipette | Fisher Scientific | 13-676-10F | |
| 25 mL serological pipette | Fisher Scientific | 12-676-10K | |
| Petri dish (60 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri dish (100 mm X 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Microscope Coverslip (18 mm) | Fisher Scientific | 12-545-100 18CIR | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3. Materials for microscopy (confocal and scanning electron microscopy) | |||
| Mouse monoclonal anti-CNPase | abcam | ab6319 | |
| Rabbit anti-Iba1 | Wako Laboratory Chemicals | 019-17741 | |
| Chicken anti-GFAP | abcam | ab4674 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | 62249 | |
| Fluoromount-G | Fisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | Buffered (10%) |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Paraformaldehyde | Electon Microscopy Sciences | 157-8 | Buffered (8%) |
| Guteraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16019 | Buffered (8%) |
| Osmium tetraoxide | Electon Microscopy Sciences | 19152 | Buffered (2%) |
| Hexamethyldilazane (HMDS) | Electon Microscopy Sciences | 16700 | |
| Ethanol (EtOH) | Electon Microscopy Sciences | 15055 | Anhydrous |
| Microscope Slide (25 X 75 X 1 mm) | VWR International | 48311-703 |
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