במבחנה SUMOylation Assay ללמוד סומו E3 ליגאז פעילות
Summary
בניגוד ligases אוביקוויטין, זוהו מספר ligases סומו E3. ששונה זה במבחנה SUMOylation פרוטוקול הוא מסוגל לזהות ligases סומו E3 הרומן מאת assay שיחזור במבחנה .
Abstract
אוביקוויטין דמוי קטן משנה (סומו) השינוי הוא שינוי post-translational חשוב (PTM) המעביר אותות בעיקר דרך להתכוונן אינטראקציות חלבון חלבון. בדומה אוביקוויטין השינוי, SUMOylation הוא בבימויו של מפל אנזים רציפים לרבות E1-מפעיל אנזים (SAE1/SAE2), E2-ההטיה אנזים (Ubc9) ו- E3 ליגאז (קרי, משפחת PIAS, RanBP2, ו- Pc2). לעומת זאת, שונה ubiquitination, E3 ליגאז הוא שאינם חיוניים עבור התגובה אך האם לספק הדיוק והיעילות סומו ההטיה. חלבונים שונה על-ידי SUMOylation יכול להיות מזוהה על ידי ויוו assay ויה immunoprecipitation עם נוגדנים ספציפיים המצע, immunoblotting עם נוגדנים ספציפיים סומו. עם זאת, ההדגמה של פעילות החלבון סומו E3 ליגאז דורש במבחנה הכינון של מבחני SUMOylation באמצעות אנזימים מטוהרים, המצע סומו חלבונים. מאז בתגובות במבחנה , בדרך כלל SAE1/SAE2, Ubc9, לבד מספיק עבור סומו ההטיה, שיפור של SUMOylation על ידי ליגאז E3 בשם לא תמיד קל לזהות. כאן, אנו מתארים יישום ששונה במבחנה פרוטוקול SUMOylation שמזהה באופן עקבי סומו שינוי באמצעות מערכת במבחנה מחדש. פרוטוקול צעד אחר צעד לטהר פעיל catalytically K-bZIP, ליגאז ויראלי E3 סומו-2/3, מוצג גם. הפעילות SUMOylation של K-bZIP מטוהרים מוצגים ב- p53, מטרה ידועה של סומו. פרוטוקול זה יכול לא רק להיות מועסק שחקרתי הרומן ligases סומו E3, אלא גם חשיפת שלהם ירידה לפרטים paralog סומו.
Introduction
סומו השינוי זוהה בתחילה כמו שינוי post-translational הפיך (PTM) המסדירה את יציבות חלבון1. בנוסף נטיה ישירה, סומו ניתן גם לחבר חלבון תוך אינטראקציה אי-קוולנטיות על-ידי סומו אינטראקציה עם מוטיבים (סימס)2. דומה קשירה של tyrosyl-זרחון על ידי מולקולות מחסה Src הומולוגיה 2 (SH2) או איגוד phosphotyrosine (PTB) תחומים3,4, סומו שינוי מספק פלטפורמה אינטראקציה נוספת עבור סלקטיבית גיוס של ה-SIM המכיל אפקטור חלבונים5,6. בנוסף רגולציה של אותות, לשרת SUMOylation של כרומטין שיפוץ מולקולות וגורמי תעתיק לווסת את ג’ין-ביטוי-7,–8. מחקרים של הגנום כולו SUMOylation דפוסי גילו כי השינוי סומו קשורה חיובית9,10 או שלילי10,11,12 שעתוק . תקנה, בין היתר בשל יחודיות paralogue של SUMOylation.
ישנם שלושה איזופורמים סומו העיקריים עבור חלבון conjugating המתנה בתאי יונקים; אלה כוללים סומו-1, ואת מאוד הומולוגי סומו-2 סומו-3 (המכונה סומו-2/3)13. סומו הוא בדרך כלל מצומדת את השאריות ליזין (K) בתוך המוטיב ψKxD/E הסכמה חלבון המטרה. ה-SIM ב- E3 סומו ligases אחראית על ירידה לפרטים paralogue14. בניגוד ubiquitination מסלולים המכיל מאות E3 ligases, היו רק כמה E3 סומו ligases זיהה15. סומו E3 ligases מוגדרים על-ידי המאפיינים כולל את היכולת שלהם (i) לאגד Ubc9, (ii) לאגד את הסומו moiety דרך תחום ה-SIM ו- (iii) לשפר את העברת סומו Ubc9 על גבי המצע. E3 ליגאז אינה נדרשת לחלוטין סומו ההטיה16, אבל מספק המצע וספציפיות סומו-paralogue. מאז בדרך כלל רק חלק קטן של החלבון המצע הכולל הוא סומו-לאחרונה, זיהוי של SUMOylated חלבונים ויוו היא תמיד אתגר. לכן, מבחני לשחזור ומדויקים הדרושים כדי להבהיר הפונקציה מדויק של השינוי סומו.
ה במבחנה SUMOylation assay, הבודקת את היכולת של Ubc9 מטוהרים כדי לעודד SUMOylation של חלבונים המצע, הוא assay היטב מקובל ללמוד סומו השינוי17. עם זאת, סומו E3 ליגאז פעילות ברוב המקרים לא ניתן לאתרם או יכול רק להיות מזוהה עם ליגאז סומו מוטציה עם גבוהה סומו E3 ליגאז פעילות וספציפיות המצע נמוך לפי הפרוטוקול הסטנדרטי עקב נוכחות כמות שופעת של Ubc918 . ההצלחה הכוללת של assay זו תלויה במידה רבה טיטרציה זהירה של Ubc9 מטוהרים. במבחנה SUMOylation וזמינותו המתוארים כאן היא שונה SUMOylation הרגיל פרוטוקול (ראה טבלה של חומרים). התצפית של שינוי סומו הכללית מוגברת במהלך הפעלה מחדש הקשורים סרקומת קפוסי ההרפס (KSHV) בקשה לנו לזהות את ליגאז סומו E3 ויראלי, שעשויים להיות אחראי להסדרת-up של SUMOylation. בעקבות ההקרנה בקנה מידה קטן של החלבונים אינטראקציה של נגיפי סומו E3 ליגאז K-bZIP, p53 מזוהה כמו מצע הרומן. ב פרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט בתאי חרקים השלבים המעורבים הביטוי ולטיהור פראי-סוג K-bZIP, נגיפי סומו E3 ליגאז עם ירידה לפרטים סומו-2/3. היכולת של מטוהרים K-bZIP כדי לשפר את SUMOylation של p53, מצע סומו ידועים, מחושבת בנוכחות כמות מופחתת של אנזימים E1, E2. שימוש assay ששונה זה SUMOylation, חוקרים יכול באופן אמין להגדיר את היכולות של סומו E3 ליגאז SUMOylate רומן או מצעים ידוע, וזה צעד ראשוני במחקר של חלבון SUMOylation. יתר על כן, שיטה זו מסייעת לזהות את הרומן ligases סומו E3 עם פעילות ליגאז נמוך אבל ירידה לפרטים המצע גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
במבחנה פרוטוקול SUMOylation המתוארים כאן באופן שגרתי משמש כדי לקבוע את מצב SUMOylation מזוהה Ubc9 סובסטרטים. המגבלה העיקרית באמצעות פרוטוקול סטנדרטי כדי לחקור את תפקוד SUMOylation סומו E3 ליגאז הוא השפע של הפעלת סומו E1, E2 conjugating אנזימים Ubc9 למקסם את ההטיה סומו במערכות במבחנה . בהתחשב באתגר זה, אנו מאמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים את משרד המדע והטכנולוגיה (רוב, 105-2320-B-010-007-MY3 כדי PCC), מן המכון מחקר הבריאות הלאומי (NHRI-EX105-10215BC כדי PCC), את משרד המדע והטכנולוגיה (ביותר 105-2314-B-400-019 כדי HJK) מ מכון המחקר הבריאות הלאומי (NHRI MG-105-SP-10, NHRI מ”ג-106-SP-10 כדי HJK). עבודה זו נתמכה גם חלקית עם האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג על כתב היד את הפרסום PCC. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או ותכליתם של כתב היד.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
