Vitro SUMOylation SUMO E3 ligaz etkinlik eğitim için tahlil
Summary
Ubikuitin ligazlar, birkaç E3 SUMO ligazlar tespit edilmiştir. Bu değiştirilmiş vitro SUMOylation Protokolü roman SUMO E3 ligazlar bir vitro sulandırma tahlil tarafından tespit edebilmek.
Abstract
Küçük Ubikuitin benzeri değiştirici (SUMO) değişiklik öncelikle protein-protein etkileşimleri oransal aracılığıyla sinyal iletimi aracılık eder önemli bir translasyonel modifikasyon (PTM) olduğunu. Ubikuitin değişikliklere benzer, SUMOylation enzim (SAE1/SAE2) E1 etkinleştirme, E2-konjugasyon enzim (Ubc9) ve E3-ligaz (Yani, PIA aile, RanBP2 ve Pc2) gibi bir sıralı enzim çağlayan tarafından yönlendirilir. Ama tepki değil ancak, ubiquitination, bir E3 ligaz gerekli olmayan farklıdır SUMO konjugasyon için hassas ve etkinliği sağlamak. SUMOylation tarafından modifiye proteinleri vivo içinde tahlil immunoprecipitation üzerinden substrat özel antikorlar ve immunoblotting SUMO özel antikorlar ile belirlenebilir. Ancak, protein SUMO E3 ligaz faaliyet gösteri arıtılmış enzim, substrat ve SUMO proteinler kullanarak SUMOylation deneyleri in vitro sulandırma gerektirir. Vitro reaksiyonlar genellikle SAE1/SAE2 ve Ubc9, yalnız SUMO konjugasyon için yeterli olduğundan, SUMOylation geliştirme sözde E3 ligaz tarafından her zaman tespit etmek kolay değildir. Burada, bir değiştirilmiş vitro sürekli olarak yeniden düzenlendi vitro sistemini kullanarak SUMO değişiklik tanımlar SUMOylation Protokolü açıklar. Catalytically etkin K-bZIP, viral bir SUMO-2/3 E3 ligaz arındırmak için adım adım bir protokol de sunulmaktadır. Arıtılmış K bZIP SUMOylation faaliyetlerinin p53, SUMO tanınmış bir hedef gösterilir. Bu protokolü yalnızca roman SUMO E3 ligazlar elucidating için aynı zamanda SUMO paralog olmalarından ifşa için istihdam edilebilir değil.
Introduction
SUMO değişiklik başlangıçta protein istikrar1düzenleyen bir tersinir translasyonel modifikasyon (PTM) tespit edilmiştir. Doğrudan fiil ek olarak SUMO Ayrıca bir protein kovalent olmayan etkileşimi aracılığıyla SUMO etkileşim motifleri (SIMs)2tarafından eklenebilir. Src homoloji 2 (SH2) barındıran moleküller tarafından tyrosyl fosforilasyon bağlama veya phosphotyrosine bağlama benzer (PTB) etki alanları3,4, SUMO değişiklik için bir ek etkileşim platformu sağlar seçici İşe Alım SIM içeren efektör proteinler5,6. Ek olarak, düzenleme, sinyal iletimi, SUMOylation molekülleri remodeling Kromatin ve transkripsiyon faktörlerinin gen ifade7,8modüle için hizmet vermektedir. Genom-wide SUMOylation desen çalışmaları SUMO değişiklik olumlu9,10 ya da negatif10,11,12 transkripsiyonu ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur yönetmelik, SUMOylation paralogue özgüllüğü nedeniyle kısmen.
Orada üç büyük SUMO izoformlarının hediye memeli hücrelerinde conjugating protein için; Bu SUMO-1 ve son derece homolog SUMO-2 ve SUMO-3 (SUMO-2/3 adlandırılır)13içerir. SUMO genellikle hedef protein ψKxD/E uzlaşma motifi içinde lizin (K) kalıntı için Birleşik. SUMO E3 ligazlar SIM’de paralogue özgüllük14için sorumludur. E3 ligazlar yüzlerce içeren ubiquitination yolları aksine sadece birkaç SUMO E3 tespit ligazlar15olmuştur. SUMO E3 ligazlar (i) Ubc9 bağlama, bağlama (II) SUMO yan SIM etki alanı ve (III) Ubc9 SUMO transfer substrat üzerine geliştirmek amacıyla yeteneklerini de dahil olmak üzere özellikleri tanımlanır. E3 ligaz SUMO konjugasyon16için kesinlikle gerekli değildir, ancak substrat ve SUMO-paralogue özgüllük sağlar. Beri genellikle Toplam yüzey proteini küçük bir kısmını SUMO-modified, sadece SUMOylated proteinler vivo içinde tespiti her zaman bir meydan okuma olduğunu. Bu nedenle, doğru ve tekrarlanabilir deneyleri SUMO değişiklik hassas işlev aydınlatmak için gereklidir.
Vitro saf Ubc9 SUMOylation substrat proteinlerin katalizler yeteneğini değerlendirir, SUMOylation tahlil SUMO değişiklik17eğitim için iyi kabul edilen bir tahlil olduğunu. Ancak, çoğu durumda SUMO E3 ligaz aktivite tespit edilemez veya sadece mutasyona uğramış SUMO ligaz ile yüksek SUMO E3 ligaz aktivite ve düşük substrat özgüllüğü ile standart iletişim kuralı tarafından Ubc918 bol miktarda varlığı nedeniyle tespit edilebilir . Bu tahlil genel başarısı büyük ölçüde saf Ubc9 dikkatli titrasyon bağlıdır. Burada anlatılan vitro SUMOylation tahlil standart bir SUMOylation değiştirilir ( Tablo malzemelerigörmek) protokol. Kaposi sarkomu ilişkili herpesvirus (KSHV) yeniden etkinleştirme sırasında artan küresel SUMO değişikliği gözlenmesi bize SUMOylation up-yönetmelik için sorumlu olabilir viral SUMO E3 ligaz tanımlamak için istenir. Viral SUMO E3 ligaz K-bZIP etkileşen proteinler küçük ölçekli Gösterimin ardından, p53 roman bir substrat tespit edilmiştir. Bu protokol için ayrıntılı böcek hücreleri ifade ve vahşi-türü K-bZIP, viral bir SUMO E3 ligaz SUMO-2/3 özgüllük ile arınma adımları yer olarak gösteriyoruz. P53, iyi bilinen bir SUMO substrat SUMOylation geliştirmek için saflaştırılmış K bZIP yeteneği E1 ve E2 enzimler azaltılmış miktarda huzurunda değerlendirilir. Bu değiştirilmiş SUMOylation tahlil kullanarak, araştırmacılar güvenilir SUMO E3 ligaz yeteneklerini SUMOylate roman ya da bilinen yüzeylerde, hangi bir protein SUMOylation çalışmanın birincil adımdır tanımlayabilirsiniz. Ayrıca, bu yöntem düşük ligaz aktivite ama yüksek substrat özgüllüğü ile roman SUMO E3 ligazlar tanımlamaya yardım eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vitro burada açıklanan SUMOylation Protokolü rutin olarak tanımlanan Ubc9 yüzeylerde SUMOylation durumunu kurmak için kullanılır. SUMO E3 ligaz SUMOylation işlevinin çalışması için standart protokolü kullanarak büyük kısıtlamadır SUMO E1 etkinleştirme ve SUMO konjugasyon vitro sistemlerinde en yüksek düzeye E2 conjugating enzimler Ubc9 bereket. Bu meydan okuma göz önüne alındığında, bu titrasyon düzeye SUMO E1 ve E2 enzim miktarının bir zar zor faaliyetlerini SUMOylation…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Bakanlığı bilim ve Teknoloji (PCC için çoğu, 105-2320-B-010-007-MY3), Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI-EX105-10215BC için PCC), Bakanlığı bilim ve Teknoloji (en 105-2314-B-400-019 tarafından desteklenmiştir HJK için) ve Ulusal Sağlık Araştırma Enstitüsü (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 HJK için). Bu eser de kısmen Ulusal Yang Ming Üniversitesi Tarih PCC yayınına el yazması ile desteklenmiştir. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya tazminat makalenin herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
