ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。
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この記事について
サマリー
要約
小さなユビキチン様修飾 (相撲) の変更は、重要な翻訳後修飾 (PTM) 主に蛋白質蛋白質の相互作用を変調を介するシグナル伝達を仲介します。ユビキチンの変更と同様に、sumo 化は E1 活性化酵素 (SAE1/SAE2)、E2 抱合 (Ubc9) E3 リガーゼ (すなわちPIA の家族、RanBP2、Pc2) など順次酵素カスケードによって監督されます。しかし、ユビキチン化とは異なる、E3 リガーゼは非本質的なため反応が相撲の活用の精度と有効性を提供します。タンパク質の sumo 化によって変更は、基質特異的抗体と相撲特異抗体と免疫ブロット免疫沈降法による生体内での試金によって識別できます。ただし、タンパク質 SUMO E3 リガーゼ活性のデモ sumo 化アッセイ精製酵素、基質、および相撲蛋白質を使用しての体外の再構成が必要です。In vitro反応で通常 SAE1/SAE2 と Ubc9 だけなので相撲の活用のために十分、sumo 化と推定される E3 リガーゼによる強化が検出する容易で常にはないです。ここで、変更された生体外の in vitro再構成システムを用いた SUMO 化を一貫して識別する sumo 化プロトコルについて述べる.触媒活性 K bZIP、ウイルス相撲-2/3 E3 リガーゼを浄化するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。精製 K bZIP の sumo 化活動は、p53、相撲の既知のターゲットに表示されます。このプロトコルないしか採用できない小説相撲 E3 リガーゼの解明その相撲パラログ遺伝子の特異性を明らかにするためにも。
概要
SUMO 化当初、タンパク質安定性1を調整する可逆的な翻訳後修飾 (PTM) として同定されました。直接活用に加えて、相撲はできます相撲相互作用モチーフ (SIMs)2非共有結合性相互作用によってタンパク質に添付も。Src ホモロジー 2 (SH2) をかくまっている分子によってチロシン リン酸化のバインディングまたはホスホチロシン結合のよう (PTB) ドメイン3,4SUMO 化のための追加の対話プラットフォームを提供します選択SIM を含むエフェクター蛋白質5,6の募集。シグナル伝達の規制に加えて転写因子とクロマチン再構築分子の sumo 化は遺伝子発現7、8を調節するのに役立ちます。ゲノム sumo 化パターンの研究は、正9,10または負の10、11<....
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プロトコル
1. バキュロ ウイルス発現コンストラクトの調製
-
相撲 E3 リガーゼ K bZIP 浄化デュアル式バキュロウイルスベクターへ K bZIP19の cDNA のクローニング (材料表参照) N 末端エピトープ タグ付き。(ベクトル-タグ-K-bZIP としてプロトコルを通して示される) オクタペプチド タグを使用して成功を収めています。
注: K bZIP ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) のクローニングのための DNA のテンプレートは cDNA の逆ドキシサイクリン治療20TREx F3H3 K-Rta BCBL 1 細胞由来 RNA から転写です。- サイトのクローンを作成私Cpoとデュアル発現ベクターにフルレングスの K bZIP cDNA19を転送します。Cpo私は PCR の製品や 3 h2137 ° C でデュアル発現ベクターの 1 μ g を消化します。
- 分離・220.8% の agarose のゲルの電気泳動、次消化の DNA を抽出します。挿入 (K bZIP) を縛るし、製造元の指示に従って 30 分の 16 ° C T4 DNA リガーゼ....
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結果
製造元によって提供される情報によると sumo 化アッセイで E1 と E2 酵素の標準量は 50 nM と 500 nM、それぞれ。E2 の最小量は酵素 Ubc9 p53 SUMOylate することができるの活用はだった最初の in vitro sumo 化アッセイによって決まります。低 Ubc9 標準、体外sumo 化の試金のプロトコルで使用される量の 5 分の 1 SUMOylate p53 効率的にすることができた (図 1A)。したがって、Ubc9 標準プロトコルで使用される量の 10 分の 1 との組み合わせで E1 酵素の量の半分は別の in vitro sumo 化アッセイに使用されました。Sumo 化効率の大幅な削減は、標準的なプロトコル (図 1B) と比較して観察されました。
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ディスカッション
プロトコルは生体外でsumo 化ここで説明は日常的に識別された Ubc9 基板の sumo 化地位を確立する使用します。相撲 E3 リガーゼの sumo 化関数を勉強する標準プロトコルを使用して主要な制限は、相撲 E1 が活性化し、E2 抱合酵素 Ubc9の in vitroにおける相撲の活用を最大化する豊富です。このような課題を考慮して考えてレベルに相撲 E1 と E2 酵素の量を滴定 1 つはかろうじて sumo 化で彼らの活動は、のみ方法利用できますこの体外を使用して相撲 E3 リガーゼ活性を決定する検出できることSumo 化システム。この仮説に従って我々 は正常に K bZIP の E3 リガーゼ活性を解明し、相撲-2/3 に向けての特異性と新規相撲 E3 リガーゼとしてそれを識別しました。
プロトコルの中で重要なステップの E1 と E2 の低量の混入であります。に示すよう図 2、小説相撲 E3 リガーゼ低リガーゼ活性を持つこれらのより低い金額を使用して基板と.......
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開示事項
著者は潜在的な利益相反を開示ないです。
謝辞
この作品は、省の科学と技術 (PCC にほとんど、105-2320-B-010-007-MY3)、国立衛生研究所 (NHRI - PCC に EX105-10215BC)、科学技術 (最も 105-2314-B-400-019 省からの助成金によって支えられました。HJK) して国立衛生研究所 (NHRI MG-105-SP-10、HJK に NHRI の MG-106 SP-10) から。この作品も、PCC に原稿出版物の国立陽明大学と部分的サポートされていました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の賠償の役割はなかった。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | 二重発現バキュロウイルスベクター |
| pCR2.1-TOPO ベクター | Invitrogen | PCR 産物ベクター | |
| コンピテントセル 大腸菌 DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | コンピテント E. coli細胞 A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | コンピテントE. coli細胞 B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | トランスフェクション試薬 |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW EnglandBioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | ガラクトシダーゼ基質 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace's 昆虫培地 | ギブコ | 11605094 | |
| ウシ胎児血清 | ギブコ | 10082147 | |
| ゲンタマイシン | サーモフィッシャー | 15750060 | |
| アンピシリン | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| カナマイシン | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| ゲンタマイシン | Gibco | 15710-064 | |
| テトラサイクリン | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB ブロス | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| ドデシル硫酸ナトリウム | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-メルカプトエタノール | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| 無脂乳 | フォンテラ | ||
| グリセリン | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | 洗剤 A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | 洗剤 B |
| ポロキサマー 188溶液 | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | 洗剤 C |
| プロテアーゼ阻害剤 カクテル錠 | ロシュ | 04-693-132-001 | |
| 3x フラッグペプチド | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 磁気ビーズ | Sigma-Aldrich | M8823 | 抗体タグ付き磁気ビーズ |
| SUMOlink SUMO-1 キット | Active Motif | 40120 | 標準 SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 キット | アクティブ モチーフ | 40220 | 標準 SUMOylation プロトコル |
| QIAquick ゲル抽出キット | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN プラスミド ミニキット | QIAGEN | 12123 | プラスミド抽出キット |
| ポリプロピレンチューブ | ファルコン | 352059 | |
| ペトリ皿 | ファルコン | 351029 | |
| セルリフター | コーニング | CNG3008 | |
| ローディングチップ | ソレンソンバイオサイエンス | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| ブロッティングフィルターペーパー | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini スラブゲル装置 (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | バイオ・ラッド | 1658001 EDU | |
| トランスブロット SD セミドライ電気泳動転写セル | Bio-Rad | 1703940 Pierce | |
| ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL試薬 |
| 懸濁液ミキサー | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| オービタルシェーカー | カンシンインスツルメンツ株式会社 | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 生体分子イメージャー | GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
参考文献
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al.
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