体外相撲 E3 リガーゼ活性を研究する sumo 化アッセイ
Summary
ユビキチンリ ガーゼとは異なりいくつかの相撲 E3 リガーゼが同定されています。この変更された体外sumo 化プロトコルの in vitro再構成法による新規相撲 E3 リガーゼを識別することです。
Abstract
小さなユビキチン様修飾 (相撲) の変更は、重要な翻訳後修飾 (PTM) 主に蛋白質蛋白質の相互作用を変調を介するシグナル伝達を仲介します。ユビキチンの変更と同様に、sumo 化は E1 活性化酵素 (SAE1/SAE2)、E2 抱合 (Ubc9) E3 リガーゼ (すなわちPIA の家族、RanBP2、Pc2) など順次酵素カスケードによって監督されます。しかし、ユビキチン化とは異なる、E3 リガーゼは非本質的なため反応が相撲の活用の精度と有効性を提供します。タンパク質の sumo 化によって変更は、基質特異的抗体と相撲特異抗体と免疫ブロット免疫沈降法による生体内での試金によって識別できます。ただし、タンパク質 SUMO E3 リガーゼ活性のデモ sumo 化アッセイ精製酵素、基質、および相撲蛋白質を使用しての体外の再構成が必要です。In vitro反応で通常 SAE1/SAE2 と Ubc9 だけなので相撲の活用のために十分、sumo 化と推定される E3 リガーゼによる強化が検出する容易で常にはないです。ここで、変更された生体外の in vitro再構成システムを用いた SUMO 化を一貫して識別する sumo 化プロトコルについて述べる.触媒活性 K bZIP、ウイルス相撲-2/3 E3 リガーゼを浄化するためにステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。精製 K bZIP の sumo 化活動は、p53、相撲の既知のターゲットに表示されます。このプロトコルないしか採用できない小説相撲 E3 リガーゼの解明その相撲パラログ遺伝子の特異性を明らかにするためにも。
Introduction
SUMO 化当初、タンパク質安定性1を調整する可逆的な翻訳後修飾 (PTM) として同定されました。直接活用に加えて、相撲はできます相撲相互作用モチーフ (SIMs)2非共有結合性相互作用によってタンパク質に添付も。Src ホモロジー 2 (SH2) をかくまっている分子によってチロシン リン酸化のバインディングまたはホスホチロシン結合のよう (PTB) ドメイン3,4SUMO 化のための追加の対話プラットフォームを提供します選択SIM を含むエフェクター蛋白質5,6の募集。シグナル伝達の規制に加えて転写因子とクロマチン再構築分子の sumo 化は遺伝子発現7、8を調節するのに役立ちます。ゲノム sumo 化パターンの研究は、正9,10または負の10、11,12転写に関連付けられていることを明らかにしました。規制で一部の sumo 化のパラログの特異性のため。
タンパク質は、哺乳類細胞で現在の活用の 3 つの主要な相撲アイソ フォームがあります。相撲-1 と高い相同性相撲 2 相撲 3 (相撲-2/3 と呼ばれる)13が含まれます。相撲は通常ターゲット蛋白質の ψKxD/E コンセンサス モチーフ内リジン (K) 残基に共役系します。相撲 E3 リガーゼの SIM はパラログ特異性14担当です。ユビキチン経路 E3 リガーゼの数百人を含むと対照をなして、いくつか相撲 E3 リガーゼ特定15するされているだけ。相撲 E3 リガーゼは、(i) Ubc9 のバインド、(ii) SIM ドメインを介して相撲部をバインドして (iii) 基板上に Ubc9 から相撲伝達を強化する能力を含むプロパティによって定義されます。E3 リガーゼは相撲活用16、絶対に必要ではないが、基板と相撲パラログの特異性を提供します。通常以来総基質タンパク質のごく一部は相撲変更だけ SUMOylated 蛋白質の生体内での検出は常に挑戦です。したがって、正確かつ再現可能なアッセイは、SUMO 化の正確な機能を解明するために必要です。
体外基質タンパク質の sumo 化を触媒する精製 Ubc9 の能力を評価、sumo 化の試金は相撲変更17を勉強するための広く受け入れられた試金。ただし、ほとんどの場合相撲 E3 リガーゼ活性を検出できないまたはできますのみによって検出される変異相撲リガーゼと高相撲 E3 リガーゼ活性と低基質特異性標準プロトコル Ubc918の豊富な量が存在するので.この試金の全体的な成功は主として精製 Ubc9 の慎重な滴定によって異なります。ここで説明した生体外でsumo 化アッセイが標準の sumo 化から変更されたプロトコル (材料の表を参照してください)。カポジ肉腫関連ヘルペス ウイルス (KSHV) の再アクティブ化の間に高められたグローバル SUMO 化の観察を求め私たちは sumo 化規制上の責任がありますウイルス相撲 E3 リガーゼを識別します。次のウイルスの相撲 E3 リガーゼ K bZIP の相互作用の蛋白質の小規模上映、p53 は新規基質として同定されました。このプロトコルでは昆虫細胞発現と野生型 K bZIP、相撲-2/3 の特異性を持つウイルス相撲 E3 リガーゼの精製の手順で詳細に紹介します。P53、よく知られている相撲の基質の sumo 化を高める精製 K bzip 型の機能は、E1 と E2 酵素の減らされた量の存在下で評価されます。この変更された sumo 化の試金を使用して、研究者確実に定義できます相撲 E3 リガーゼの能力 SUMOylate 小説または知られている基板に sumo 化における主要なステップであります。また、このメソッド低リガーゼ活性が高い基質特異性を持つ新規相撲 E3 リガーゼを識別に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは生体外でsumo 化ここで説明は日常的に識別された Ubc9 基板の sumo 化地位を確立する使用します。相撲 E3 リガーゼの sumo 化関数を勉強する標準プロトコルを使用して主要な制限は、相撲 E1 が活性化し、E2 抱合酵素 Ubc9の in vitroにおける相撲の活用を最大化する豊富です。このような課題を考慮して考えてレベルに相撲 E1 と E2 酵素の量を滴定 1 つはかろうじて sumo 化?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、省の科学と技術 (PCC にほとんど、105-2320-B-010-007-MY3)、国立衛生研究所 (NHRI – PCC に EX105-10215BC)、科学技術 (最も 105-2314-B-400-019 省からの助成金によって支えられました。HJK) して国立衛生研究所 (NHRI MG-105-SP-10、HJK に NHRI の MG-106 SP-10) から。この作品も、PCC に原稿出版物の国立陽明大学と部分的サポートされていました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の賠償の役割はなかった。
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
