In Vitro SUMOylation analysen å studere SUMO E3 Ligase aktivitet
Summary
I motsetning til ubiquitin ligases, har noen E3 SUMO ligases blitt identifisert. Dette endret i vitro SUMOylation protokollen er kjøpedyktig identifisere romanen SUMO E3 ligases ved i vitro rekonstituering analysen.
Abstract
Små ubiquitin som modifikator (SUMO) endring er en viktig post-translasjonell modifikasjon (PTM) som formidler signaltransduksjon primært gjennom modulerende protein-protein interaksjoner. Lik ubiquitin endring, SUMOylation er regissert av en sekvensiell enzym cascade inkludert E1-aktivere enzym (SAE1/SAE2), E2-Bøyning enzym (Ubc9) og E3-ligase (dvs., PIAER for familien, RanBP2 og Pc2). Men forskjellig fra ubiquitination, en E3 ligase er uvesentlig for reaksjonen men ikke gir presisjon og effekt SUMO Bøyning. Proteiner modifisert av SUMOylation kan identifiseres ved i vivo analysen via immunoprecipitation med substrat-spesifikke antistoffer og immunoblotting med SUMO-spesifikke antistoffer. Demonstrasjon av protein SUMO E3 ligase aktivitet krever imidlertid i vitro rekonstituering av SUMOylation analyser renset enzymer, substrat og SUMO proteiner. Siden i vitro reaksjoner, vanligvis SAE1/SAE2 og Ubc9, alene er tilstrekkelig for SUMO Bøyning, er forbedring av SUMOylation av en antatte E3-ligase ikke alltid lett å oppdage. Her beskriver vi en modifisert i vitro SUMOylation protokollen som konsekvent identifiserer SUMO modifisering benytter en i vitro rekonstituert system. En trinnvis protokoll å rense katalytisk aktive K-bZIP, en viral SUMO-2/3 E3 ligase, er også presentert. SUMOylation aktiviteter renset K-bZIP vises på p53, en velkjent mål i SUMO. Denne protokollen kan ikke bare være ansatt for Klargjørende romanen SUMO E3 ligases, men også for å avsløre deres SUMO paralog spesifisitet.
Introduction
SUMO endring ble først identifisert som en reversibel post-translasjonell modifikasjon (PTM) som regulerer protein stabilitet1. I tillegg til direkte Bøyning, kan SUMO også knyttes til et protein gjennom ikke-kovalente samhandling med SUMO samhandling motiver (SIMs)2. Lignende til binding av tyrosyl-fosforylering av molekyler skjuler Src homologi 2 (SH2) eller phosphotyrosine binding (PTB) domener3,4, SUMO modifisering har en ekstra samspill plattform for selektiv Rekruttering SIM inneholder effektor proteiner5,6. I tillegg til regulering av signaltransduksjon tjene SUMOylation transcriptional faktorer og chromatin remodeling molekyler å modulere gene expression7,8. Studier av genomet hele SUMOylation mønstre har avdekket at SUMO endringen er assosiert med positiv9,10 eller negativ10,11,12 transkripsjon regulering, delvis på grunn av paralogue spesifisiteten av SUMOylation.
Det er tre store SUMO isoformene for protein bøye dag i pattedyrceller; Disse inkluderer SUMO-1, og svært homologe SUMO-2 og SUMO-3 (referert til SUMO-2/3)13. SUMO er vanligvis konjugert til lysin (K) rester i ψKxD/E konsensus motivet i målet protein. SIM i SUMO E3 ligases er ansvarlig for det paralogue spesifisitet14. I motsetning til ubiquitination veier som inneholder hundrevis av E3 ligases, har det bare vært et par SUMO E3 ligases identifisert15. SUMO E3 ligases defineres av egenskaper inkludert deres evne til å (i) binde Ubc9, (ii) binder SUMO moiety via et SIM-domene og (iii) forbedre SUMO overføring fra Ubc9 på underlaget. E3 ligase er ikke absolutt nødvendig for SUMO Bøyning16, men gir substrat og SUMO-paralogue spesifisitet. Siden vanligvis bare en brøkdel av det totale substrat proteinet er SUMO-endret, er oppdagelsen av SUMOylated proteiner i vivo alltid en utfordring. Derfor er nøyaktig og reproduserbar analyser nødvendig for å belyse presis funksjonen til SUMO modifisering.
Den i vitro SUMOylation analysen, som evaluerer evne til renset Ubc9 å katalysere SUMOylation substrat proteiner, er en godt akseptert analysen for å studere SUMO endring17. Men SUMO E3 ligase aktivitet i de fleste tilfeller ikke kan oppdages eller bare bli oppdaget med mutert SUMO ligase med høy SUMO E3 ligase aktivitet og lav substrat spesifisitet av standard protokoll på grunn av en rikelig mengde Ubc918 . Den totale suksessen til denne analysen avhenger i stor grad forsiktig Serine renset Ubc9. I vitro SUMOylation analysen beskrevet her er endret fra en standard SUMOylation protokollen (se Tabell for materiale). Observasjon av økt global SUMO modifisering under Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV) reaktivering bedt oss å identifisere det viral SUMO E3-ligase som kan være ansvarlig for opp-regulering av SUMOylation. Etter en småskala screening av samspill proteiner av viral SUMO E3 ligase K-bZIP, p53 ble identifisert som en roman substrat. I denne protokollen viser vi detaljert i insekt celler trinnene involvert i uttrykk og rensing av vill-type K-bZIP, en viral SUMO E3 ligase med SUMO-2/3 spesifisitet. Evne til det renset K-bZIP å forbedre SUMOylation av p53, en velkjent SUMO underlaget, evalueres i nærvær av redusert mengder E1 og E2 enzymer. Bruker denne endrede SUMOylation analysen, kan forskere pålitelig Definer evnene til SUMO E3 ligase SUMOylate roman eller kjente underlag, som er en primær steg i studiet av protein SUMOylation. Videre er hjelper denne metoden identifisere romanen SUMO E3 ligases med lav ligase aktivitet, men høy substrat spesifisitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den i vitro SUMOylation-protokoll beskrevet her brukes rutinemessig til å etablere SUMOylation status identifisert Ubc9 underlag. Den store begrensningen bruke standardprotokollen for å studere SUMOylation funksjonen til SUMO E3 ligase er overflod av aktivering av SUMO E1 og E2 bøye enzymer Ubc9 som maksimerer SUMO bøyning i in vitro -systemer. Vurderer denne utfordringen tror vi at titrering mengden av SUMO E1 og E2 enzymer til nivå at man knapt kan oppdage sin aktivitet i SUMOylation finnes det b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra departementet for vitenskap og teknologi (mest, 105-2320-B-010-007-MY3 til PCC), fra National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC til PCC), fra departementet for vitenskap og teknologi (mest 105-2314-B-400-019 til HJK) og fra National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 til HJK). Dette arbeidet ble også støttet delvis med National Yang-Ming University med manuskriptet publikasjon til PCC. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, innsamling og analyse, beslutningen om å publisere eller oppreisning av manuskriptet.
Materials
| pFastBac | Invitrogen | 10359-016 | dual expression baculovirus vector |
| pCR2.1-TOPO vector | Invitrogen | PCR product vector | |
| competent cell E. coli DH5α | Yeastern Biotech | FYE678-80VL | competent E. coli cells A |
| E. coli DH10Bac | Invitrogen | 10359-016 | competent E. coli cells B |
| FugeneHD | Roche | 04709705001 | transfection reagent |
| Opti-MEM | Gibco | 31985062 | reduced serum media |
| T4 Ligase | NEW England BioLabs | M0202S | |
| CpoI (RsrII) | Thermo Scientific | ER0741 | |
| Bluo-gal | Thermo Scientific | B1690 | galactosidase substrate |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
| Grace’s Insect Medium | Gibco | 11605094 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10082147 | |
| Gentamicin | Thermo Fisher | 15750060 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-25G | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | K0254-20ML | |
| gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| tetracyclin | Sigma-Aldrich | 87128-25G | |
| LB Broth | Merk | 1.10285.0500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-5KG | |
| KCl | Merk | 1.04936.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | |
| KH2PO4 | J.T.Baker | 3246-01 | |
| sodium dodecyl sulfate | Merk | 1.13760.1000 | |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 161-0710 | |
| TRIS (Base) | J.T.Baker | 4109-06 | |
| Non-fat milk | Fonterra | ||
| glycerol | J.T.Baker | 2136-01 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | detergent A |
| Tween 20 | Amresco | 0777-500ML | detergent B |
| Poloxamer 188 solution | Sigma-Aldrich | P5556-100ML | detergent C |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablet | Roche | 04 693 132 001 | |
| 3x Flag peptide | Sigma | F4799 | |
| anti-FLAG m2 Magnetic beads | Sigma-Aldrich | M8823 | antibody-tagged magnetic beads |
| SUMOlink SUMO-1 Kit | Active Motif | 40120 | standard SUMOylation protocol |
| SUMOlink SUMO-2/3 Kit | Active Motif | 40220 | standard SUMOylation protocol |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
| QIAGEN Plasmid Mini Kit | QIAGEN | 12123 | plasmid extraction kit |
| Polypropylene tubes | Falcon | 352059 | |
| Petri Dish | Falcon | 351029 | |
| Cell lifter | Corning | CNG3008 | |
| Loading tip | Sorenson BioScience | 28480 | |
| PVDF | PerkinElmer | NEF1002 | |
| Blotting filter paper | Bio-Rad | 1703932 | |
| Mini slab gel apparatus (Bio-Rad Mini Protean II Cell) | Bio-Rad | 1658001 EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Pierce ECL Western Blotting | Thermo | 32106 | ECL reagent |
| suspension mixer | Digisystem laboratory instruments Inc. | SM-3000 | |
| orbital shaker | Kansin instruments Co. | OS701 | |
| ImageQuant LAS 4000 biomolecular imager |
GE Healthcare | 28955810 | |
| Sf9 | Thermo Scientific | B82501 | |
| anti-p53 antibody | Cell Signaling | #9282 | |
| anti-rabbit antibody | GE Healthcare | NA934-1ML |
References
- Bies, J., Markus, J., Wolff, L. Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity. J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).
- Lin, D. Y., et al. Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors. Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).
- Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells. J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).
- Huang, W. Q., et al. Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis. Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).
- Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin. Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).
- Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins. EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).
- Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex. Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).
- Lyst, M. J., Stancheva, I. A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation. Biochem Soc Trans. 35, 1389-1392 (2007).
- Liu, H. W., et al. Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes. Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).
- Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast. Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).
- Chang, P. C., et al. The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus reactivation. BMC Genomics. 14, 824 (2013).
- Neyret-Kahn, H., et al. Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation. Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).
- Tatham, M. H., et al. Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9. J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).
- Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson. World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).
- Gareau, J. R., Lima, C. D. The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).
- Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1. Cell. 108 (3), 345-356 (2002).
- Knipscheer, P., et al. Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination. Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).
- Vethantham, V., Manley, J. L. In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121 (2009).
- Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus. J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).
- Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation. PLoS Pathog. 11 (7), 1005051 (2015).
- Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. RsrII–a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site. Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).
- Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis. J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).
- Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).
- Gingold, E. B. Bacterial transformation. Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).
- Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain. Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).
