우리 신경 조상 세포의 히스톤 3 리 79 dimethylation (H3K79me2)-내에 있는 히스톤 마크 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 미 발달 및 출생 후 뇌 조직에서 문화를 격리 하는 효과적이 고 재현 가능한 방법을 제시는 히스톤 3의 구형 도메인입니다.
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방법 논문
절연 및 신경 창시자 Chromatin-Immunoprecipitation 히스톤 3 리 79 Dimethylation 마크의 뒤의 재배
이 논문에서
요약
초록
두뇌 개발 transcriptional 프로그램과 다른 morphogens의 기울기로 영역 공간 방식으로 제어 되는 복잡 한 과정 이다. 또한, 히스톤 메 틸 화 처럼 epigenetic chromatin 수정 설치 하 고이 프로세스에서 특정 세포 운명을 유지에 대 한 중요 한 역할이 있다. 대부분 히스톤 메 틸 화는 히스톤 한정자, 지우개, 및 히스톤 리더 단백질 유연한 히스톤 꼬리에 발생 합니다. 대조적으로, H3K79 메 틸 화는 히스톤 3의 구형 도메인에 있으며 다른 발달 기능에 연루. H3K79 메 틸 화 봤을 보존 하 고 찾을 수 있습니다 다양 한 종에서에서 호모 사피엔스 에서 Saccharomyces cerevisiae. 수정 신경 창시자를 포함 한 유기 체 내의 다른 세포 인구에서 발생 합니다. 히스톤 3의 구형 도메인에서 H3K79 메 틸 화의 위치는 평가 하기 어려운 있습니다. 여기, 우리가 격리 하는 방법을 제시 하 고 문화 대뇌 피 질의 조상 세포 (Cpc) 배아 대뇌 피 질의 뇌 조직 (E11.5-E14.5) 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자 (CGNPs)에서 출생 후 조직 (P5-P7), 그리고 효율적으로 immunoprecipitate에서 정량 PCR (정량) 및 게놈 넓은 시퀀싱에 대 한 H3K79me2.
서론
두뇌의 감각, 모터, 및 인식 함수는 매우 복잡 하 고 물리적, 환경 변화에 취약 합니다. 깊이 연결 되는 3 개의 일반적인 부품은 뒷 다리-, 중간-및 개, 두뇌에 의하여 이루어져 있다. 개, 내는 telencephalon 등 telencephalon (DT)와 복 부 telencephalon (VT)으로 나눌 수 있습니다. 6 대뇌 피 질의 레이어 E11.5와 E18.5 사이 "내부-아웃" 방식으로1에서 형성 되는 쥐의 DT에 의하여 이루어져 있다. 버몬트 나중 형성 기초 중추2,3개발에 절 정령을 포함 합니다. 여러 종류 나눌 수 있다 신경, 이다, 또는 oligodendrocytes4같은 포유류 중추에서5영역 공간으로에서 발전 하는. 첫째, 신경 조상 세포 (Npc)에 게 상승 다른 종류의 뉴런, 버몬트, 및 프로젝션 뉴런 수 DT에서 그리고 glial 세포 (예를 들면, 이다6) 나중에. 대뇌 피 질의 개발, 가장 표면 층 (전 층), 먼저 형성 된다 Cajal Retzius 셀 포함. 다음, ....
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프로토콜
프라이부르크 대학교와 지방 자치 단체의 동물 복지 위원회 승인 다음 프로토콜에서 언급 된 모든 동물 실험 (G12/13, G16/11).
1입니다. 준비
-
Cpc 격리에 대 한 준비
- 타임 (E11.5 E14.5 사이) 피 질 개발의 다른 단계에서 배아를 짝짓기를 설정 합니다. 적어도 8 주 오래 되는 스트레인 NMRI (해군 의학 연구소)의 마우스를 사용 합니다. 짝짓기 후 E0.5에서 긍정적인 질 플러그를 고려 하십시오.
- 충분 한 물자가 E12.5 또는 E14.5의 외피가에서 한 H3K79me2 칩에 대 한 NMRI 쥐의 한 쓰레기를 사용 합니다. 배아 단계 나중에 대 한 더 많은 칩 분석에 대 한 한 쓰레기를 사용 (평균 담가 크기 NMRI: 10 배아).
- 쿨 Hank´s 균형 소금 솔루션 (HBSS) 및 4 ° c (RT에서 장기 저장) 인산 염 버퍼 염 (PBS).
- Equilibrate 4 ° C 저장 트립 신-EDTA (0.05 %w / v) 37 ° c
- 준비 대뇌 피 질의 세포 매체 (CCM): 2% (v/v) B-27 보충, 5 µ g/mL Apo 올려진다....
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결과
신경 조상 격리, 재배, H3K79me2 칩과 칩 분석 방법의 일반적인 계획: 그림 1 H3K79me2 칩 또는 소 뇌과 립 상 신경 창시자의 미 발달 두뇌 개발 하는 동안 다른 시간 지점에서 대뇌 피 질의 조상 세포의 출생 후 단계에서 수행 하는 순서도 보여 줍니다. 첫 번째 단계로 뇌 격리 하 고 telencephalon (E11.5 E14.5 사이) 또는 소 뇌 (P5-P7)을 검색할 수 있다. DT는 VT로 나누어는 telencephalon의 다른 지구를 분석 가능 이후에 조직 균질 것 이다 고 신경 창시자 차별. 지금, 그것은 뿌리 세포 문화 DOT1L 억제제와 그들을 치료 하입니다. 또 다른 가능성은 창시자를 직접 수정 하 여 칩 절차 그들의 대상이입니다. 칩,는 chromatin 200-500 bp의 조각으로 전단 고 H3K79me2에 대 한 자석 구슬 결합 항 체로 그 후 .......
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토론
히스톤 수정, 녹음 방송 요인, 히스톤 코드 독자, 작가, 또는 지우개의 게놈 인 검출 하기 chromatin immunoprecipitation를 수행 하기 위해 두 가지 주요 방법이 있다. 하나는 nuclease 소화, immunoprecipitation에 대 한 네이티브 chromatin를 사용 하 여 네이티브 칩 방법 이며 다른 PFA 고정, 전단 chromatin, 있는 nucleosomes와 다른 DNA 연결 단백질 covalently에 바인딩된 DNA를 사용 하 여 제시 방법 39. 네이티브 칩의 높은 항 체 탐지 레이트와 히스톤 메 틸 화는 염색 질부터 적용 해야 및 히스톤 methylations는 칩에 걸쳐 상대적으로 안정적인. 하지만 시작 물자의 다량이 필요 하 고, 그것에 적용 되지 않습니다 대뇌 나 소 뇌 개발 공부 마우스 두뇌 세포의 수는 일반적으로 제한. 우리는 항 체는 특별히 감소 H3K79me2 신호 칩 정량 분석 및 immunoblots (
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공개 사항
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심 선언
감사의 글
우리 감사 Henriette Bertemes 실험실 내 CGN 재배 프로토콜을 설정 하는 데 도움. 이 방법은 종이 DFG 투자 CRC992 의료 Epigenetics tv 자금으로 지원 했다. 저자 인정 프라이부르크 갤럭시 팀의 지원: Pavankumar Videm, 비 Grüning와 교수 Rolf Backofen, 생물 정보학, Freiburg의 대학, 독일 공동 연구 센터 992 의료 Epigenetics (DFG 부여 SFB 992/1 2012)에 의해 투자 독일 연방 교육부의 교육 및 연구 (BMBF 그랜트 031 A538A 로얄 (드. NBI))입니다.
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재료
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| CGM: CGNP 세포 배양 배지 |
참고문헌
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).
- Kandel, E. R., Squire, L. R. Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind. Science....
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