Studio In Vivo del metabolismo del glucosio nei topi di dieta-federazione di grassi utilizzando Test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e Test di tolleranza dell'insulina (ITT)
Summary
L’articolo attuale descrive la generazione e la caratterizzazione metabolica di topi di dieta-federazione di grassi come modello di resistenza all’insulina indotta da dieta e obesità. È dotato di ulteriori protocolli dettagliati per eseguire il test di tolleranza al glucosio orale e la prova di tolleranza dell’insulina, monitoraggio corpo intero alterazioni del metabolismo del glucosio in vivo.
Abstract
L’obesità rappresenta il singolo fattore di rischio più importante nella patogenesi del diabete di tipo 2, una malattia che è caratterizzata da una resistenza all’assorbimento insulina-stimolato del glucosio e un grave scompenso del metabolismo del glucosio sistemico. Nonostante i notevoli progressi nella comprensione del metabolismo del glucosio, i meccanismi molecolari della relativa regolazione nella salute e nella malattia rimangono sotto-studiato, mentre nuovi approcci per prevenire e curare il diabete sono urgentemente necessari. Dieta derivato glucosio stimola la secrezione pancreatica di insulina, che serve come il principale regolatore dei processi anabolici cellulari durante lo stato alimentato e così saldi di glucosio nel sangue livelli per mantenere lo stato energetico sistemico. Sovralimentazione trigger meta-infiammazione cronica, che conduce alle alterazioni in insulina periferica associata al recettore di segnalazione e così riduce la sensibilità all’insulina-mediato del glucosio. Questi avvenimenti in definitiva frutto in glucosio a digiuno elevato e livelli di insulina come pure una riduzione nella tolleranza al glucosio, che a sua volta servire come importanti indicatori di insulino-resistenza. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione e la caratterizzazione metabolica di dieta ad alta percentuale di grassi (HFD)-topi alimentati come un modello di uso frequente dell’insulinoresistenza indotta da dieta. Vi illustriamo in dettaglio il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT), che controlla lo smaltimento periferico di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, vi presentiamo un protocollo per la prova di tolleranza dell’insulina (ITT) monitorare l’azione dell’insulina del corpo intero. Insieme, questi metodi e le loro applicazioni a valle rappresentano potenti strumenti per caratterizzare il fenotipo metabolico generale dei topi come pure per quanto riguarda in particolare valutare le alterazioni nel metabolismo del glucosio. Possono essere particolarmente utili nel campo della ricerca ampia di insulino-resistenza, diabete e obesità per fornire una migliore comprensione della patogenesi anche per testare gli effetti degli interventi terapeutici.
Introduction
Nel mondo sviluppato, l’obesità e il diabete ha raggiunto dimensioni epidemiche a causa di inattività fisica e il consumo eccessivo di alimenti trasformati, effetti che sono guidati da rapida urbanizzazione, industrializzazione, nonché la globalizzazione. Anche se ricerca su insulino-resistenza e di comorbilità, come iperlipidemia e aterosclerosi, ha guadagnato la protuberanza durante gli ultimi decenni, i complessi meccanismi biologici che regolano il metabolismo nella salute e nella malattia rimangono in modo incompleto capito e c’è ancora un urgente bisogno di nuove modalità di trattamento prevenire e curare queste malattie1.
Insulina e glucagone ormoni contro-regolatori di servire come i principali regolatori dell’equilibrio di alimentazione e dei macronutrienti energia cellulare, mantenendo così anche sangue sistemica adeguata glucosio concentrazioni2. Il glucosio stesso agisce come uno degli principali stimolatori della secrezione dell’insulina da β-cellule pancreatiche, mentre altri macronutrienti, fattori umorali come input neurali ulteriormente modificare questa risposta. Insulina di conseguenza innesca i processi anabolici di stato alimentato facilitando la diffusione di glucosio nel sangue in eccesso nelle cellule muscolari e adipose e ulteriormente attivando la glicolisi come pure proteina – o sintesi degli acidi grassi, rispettivamente. Inoltre, l’insulina sopprime la produzione di glucosio epatico inibendo la gluconeogenesi. Consumo di energia in eccesso cronica e meta-infiammazione portano a iperinsulinemia e insulino-resistenza periferico dovuto il giù-regolamento dell’espressione del recettore dell’insulina, nonché alterazioni in vie di segnalazione a valle, così con conseguente alterata sensibilità a disposizione insulina-mediato del glucosio come pure insufficiente inibizione della produzione epatica di glucosio3,4,5,6.
Una vasta gamma di modelli animali con induzione genetici, nutrizionali o sperimentale della malattia hanno dimostrato di essere ottimi strumenti per studiare i meccanismi molecolari dell’insulino-resistenza e varie forme di diabete come pure le relative malattie accompagnamento7 . Un primo esempio è il modello ampiamente usato e ben consolidata del mouse HFD-indotta, che è caratterizzato da aumento di peso a causa di ingestione dietetica aumentata in combinazione con efficienza metabolica ridotta, con conseguente insulino resistenza8, 9. sia in modelli animali ed in esseri umani, un’elevazione nel digiuno del glucosio e dell’insulina nel sangue, così come un’alterata tolleranza alla somministrazione di glucosio sono frequentemente utilizzati indicatori di insulino-resistenza e altre alterazioni sistemiche di glucosio metabolismo. Monitoraggio del glucosio e dell’insulina nel sangue allo stato basale o dopo stimolazione sono pertanto facilmente accessibile letture.
Il presente protocollo descrive la generazione di topi HFD-federazione così come i due metodi utilizzati di frequente, il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) e la prova di resistenza di insulina (ITT), che sono utili per caratterizzare il fenotipo metabolico e per studiare alterazioni nel metabolismo del glucosio. Descriviamo il OGTT in dettaglio, che valuta la disposizione di una secrezione di insulina e carico di glucosio somministrato per via orale nel corso del tempo. Inoltre, forniamo le istruzioni su come condurre la ITT per studiare il corpo intero dell’insulina-azione di monitoraggio concentrazione del glucosio nel sangue in risposta ad un bolo di insulina. I protocolli descritti in questo articolo sono ben stabiliti e sono stati utilizzati in molteplici studi10,11,12. Oltre a lievi modifiche che possono contribuire ad per aumentare il successo, forniamo le linee guida per il disegno sperimentale e analisi dei dati, nonché utili suggerimenti evitare potenziali insidie. I protocolli descritti nel presente documento possono essere strumenti molto potenti per studiare l’influenza della genetici, farmacologici, dietetici e altri fattori ambientali sul metabolismo del glucosio di tutto il corpo e il suoi disturbi associati come l’insulino-resistenza. Oltre alla stimolazione con glucosio o insulina, una varietà di altri composti può essere utilizzata per la stimolazione a seconda dello scopo della ricerca individuale. Anche se fuori dell’ambito di questo manoscritto, molte altre applicazioni a valle possono essere eseguite su campioni di sangue prelevato, come l’analisi dei valori di sangue diverso da quello del glucosio e dell’insulina (ad es., lipidico e lipoproteico profili) così come dettagliate analisi di marcatori metabolici (ad es., da tempo reale quantitativa Polymerase Chain Reaction (PCR), l’analisi Western blot ed Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Ulteriormente il flusso cytometry e fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) può essere applicato per studiare gli effetti in popolazioni distinte delle cellule singole, mentre trascrittomica, proteomica e metabolomica approcci possono anche essere utilizzati per l’analisi non mirati.
In generale, forniamo un semplice protocollo per generare un modello di topo HFD-indotta, mentre ulteriormente descrive due approcci potenti per studiare alterazioni metaboliche del corpo intero, il OGTT e ITT, che possono essere strumenti utili per lo studio della patogenesi della malattia e lo sviluppo di nuove terapie, soprattutto nel campo della malattie metabolismo-associate come l’insulino-resistenza e diabete.
Protocol
Representative Results
Discussion
Con l’alta prevalenza di diabete e le malattie associate nella popolazione del mondo, c’è una forte esigenza di ricerca affrontando il meccanismo molecolare, prevenzione e trattamento della malattia19. Il protocollo presentato descrive metodi consolidati per la generazione di topi HFD, un robusto modello animale utilizzato per ricerca metabolica, come pure la conduzione del OGTT e ITT, che sono potenti strumenti per la valutazione delle alterazioni metaboliche del corpo intero come insulino-resis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal Comitato medico scientifico del fondo del sindaco della città di Vienna e la Österreichische Gesellschaft für Gießen und Klinische Chemie.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
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