Исследование в Vivo метаболизма глюкозы в высоким содержанием жиров диеты кормили мышей с использованием тест на переносимость глюкозы в устной (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT)
Summary
Нынешняя статья описывает поколения и метаболических характеристик как модель диета индуцированного инсулина сопротивления и ожирение высоким содержанием жиров диеты кормили мышей. Далее к услугам подробные протоколы для выполнения тест толерантности устные глюкозы и инсулина тест толерантности, мониторинг всего тела изменения глюкозы метаболизм в естественных условиях.
Abstract
Ожирение является наиболее важным фактором риска в патогенезе сахарного диабета 2 типа, болезни, которая характеризуется сопротивления инсулина стимулирует глюкозы и валовой декомпенсация метаболизма глюкозы системных. Несмотря на значительный прогресс в понимании метаболизма глюкозы молекулярные механизмы его регулирования в области здравоохранения и болезни остаются под расследование, хотя срочно необходимы новые подходы к профилактике и лечению диабета. Диета, производные глюкозы стимулирует панкреатическую секрецию инсулина, который служит в качестве основной регулятор клеточных анаболических процессов во время кормили- и таким образом балансирует уровень глюкозы в крови уровней для поддержания статуса системного энергии. Хронический overfeeding триггеры мета воспаления, что приводит к изменениям в периферийных инсулина рецептор связанные сигнализации и таким образом уменьшает чувствительность к утилизацию глюкозы, инсулина опосредованной. Эти события в конечном итоге привести к повышенный уровень глюкозы натощак и уровень инсулина, а также снижение толерантности к глюкозе, которые в свою очередь служат важными показателями сопротивления инсулина. Здесь, мы представляем протокол для генерации и метаболических характеристик высоким содержанием жиров диеты (HFD)-кормили мышей как часто используемые модели диета индуцированного инсулина сопротивления. Мы в деталях иллюстрируют устный тест на переносимость глюкозы (ТТГ), который контролирует периферической утилизации перорального глюкозы нагрузки и инсулина секреции с течением времени. Кроме того мы представляем протокол для инсулина терпимости испытания (ITT) для мониторинга действий всего тела инсулина. Вместе эти методы и их нисходящие приложения представляют собой мощные инструменты, чтобы охарактеризовать общие метаболического фенотипа мышей, а также конкретно оценить изменения в метаболизме глюкозы. Они могут быть особенно полезны в области широких исследований сопротивление инсулина, диабета и ожирения для обеспечения лучшего понимания патогенеза, а также чтобы проверить действие терапевтических вмешательств.
Introduction
В развитых странах ожирение и диабет достиг эпидемии размеры из-за отсутствия физической активности и избыточного потребления переработанных продуктов питания, последствия, которые вызваны быстрой урбанизации, индустриализации, а также глобализации. Хотя исследования на сопротивление инсулина и сопутствующие заболевания, такие как гиперлипидемии и атеросклероза, приобрела известность в течение последних десятилетий, сложных биологических механизмов, которые регулируют метаболизм в здоровье и болезни остаются неполностью понимать и по-прежнему существует настоятельная необходимость для новых методов лечения для предотвращения и лечения этих заболеваний1.
Инсулина и его дерегулирующее Гормон глюкагон служат в качестве главных регуляторов клеточной энергии питания и макро баланса, таким образом также поддержание надлежащего системного крови глюкозы концентрации2. Глюкоза, сам действует как одним из основных стимуляторов секреции инсулина β-клеток поджелудочной железы, в то время как другие макроэлементы, гуморальных факторов, а также нейронных ввода далее изменить этот ответ. Инсулин следовательно инициирует анаболические процессы ФРС государства путем содействия распространению избыток крови глюкозы в мышечных и жировых клеток и далее активации гликолиза, а также белка – или синтез жирных кислот, соответственно. Кроме того инсулин подавляет вывод глюкозы в печени путем ингибирования глюконеогенеза. Хронический избыток энергии потребления и мета воспаление приводит к гиперинсулинемия и периферийных инсулина сопротивления вниз регуляции экспрессии рецепторов инсулина, а также изменения в течению сигнальных путей, что приводит в нарушение чувствительность к глюкоза, инсулин опосредованной утилизации, а также недостаточно ингибирование печеночных глюкозы производства3,4,5,6.
Широкий спектр животных моделей с генетической, питания или экспериментальных индукции болезни было доказано быть отличные инструменты для изучения молекулярных механизмов сопротивления инсулина и различных формах диабета, а также его сопутствующих заболеваний7 . Ярким примером является широко используемым и хорошо создана HFD-индуцированной мыши модель, которая характеризуется быстрое увеличение веса за счет увеличения рацион в сочетании с сокращением метаболические эффективность, привело инсулина сопротивления8, 9. как в модели животных и людей, высоте голодного уровня в крови глюкозы и инсулина, а также нарушение толерантности глюкозы администрации являются часто используемые показатели сопротивления инсулина и других системных изменений глюкозы метаболизм. Таким образом, мониторинга глюкозы и инсулина в крови на базальную государства или после стимуляции являются легко доступными отсчетов.
Настоящий Протокол излагаются поколения HFD-кормили мышей, а также два часто используемых методов, устный тест на переносимость глюкозы (ТТГ) и инсулин сопротивление испытания (ITT), которые являются полезными для характеризуют метаболического фенотипа и расследования изменения в метаболизме глюкозы. Мы описываем ТТГ в деталях, который оценивает распоряжение перорального глюкозы нагрузки и инсулина секреции с течением времени. Кроме того мы предоставляем инструкции о том, как проводить ITT для расследования всего тела инсулин действия путем мониторинга концентрации глюкозы крови в ответ на болюсного инсулина. Протоколы, описанные в этой статье хорошо известны и были использованы в нескольких исследованиях10,,1112. Помимо незначительные изменения, которые могут помочь увеличить успех мы предоставляем руководства для экспериментального дизайна и анализа данных, а также полезные советы избежать потенциальных ошибок. Протоколы, описанные здесь, могут быть очень мощные инструменты, чтобы исследовать влияние генетических, фармакологических, пищевых и других экологических факторов на метаболизм глюкозы всего тела и его связанных расстройств, таких как сопротивление инсулина. Помимо стимуляции с глюкозы и инсулина целый ряд других соединений может быть использован для стимуляции в зависимости от назначения отдельных исследований. Хотя за пределами сферы действия этой рукописи, многие другие нисходящие приложения могут выполняться на Рисованные крови, такие как анализ крови значений, отличных от глюкозы и инсулина (например, липидов и липопротеинов профили) а также подробную анализ метаболических маркеров (например, количественные реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР), Западный анализ помаркой и твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA)). Далее проточная цитометрия и флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) могут быть применены к исследовать эффекты в популяциях различных одной ячейки, в то время как транскриптомики, протеомических и Метаболомные подходы могут быть использованы для нецелевого анализа.
В целом, мы предоставляем простой протокол для создания модели HFD-индуцированной мыши, описывая далее два мощных подходы к изучению метаболические изменения всего тела, ТТГ и МТС, который может быть полезным инструментом для изучения патогенеза заболевания и Разработка новых методов лечения, особенно в области метаболизма ассоциированных заболеваний, таких как сопротивление инсулина и диабет.
Protocol
Representative Results
Discussion
С высокой распространенности диабета и сопутствующих заболеваний населения в мире существует сильное требование для адресации молекулярный механизм, профилактики и лечения заболеваний19исследований. Представленные протокол описывает устоявшиеся методы для генерации HF…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано медицинского научного фонда мэра города Вены и Österreichische гезельшафт фюр Laboratoriumsmedizin унд клиническая Chemie.
Materials
| Mouse strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | LFD/HFD |
| Accu Chek Performa – Glucometer | Roche | 6870228 | OGTT/ITT |
| Accu Chek Performa – Strips | Roche | 6454038 | OGTT/ITT |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma-Aldrich | G8769 | OGTT |
| Actrapid – Insulin | Novo Nordisk | 417642 | ITT |
| Reusable Feeding Needles | Fine Science Tools | #18061-22 | OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice) |
| Omnifix-Fine dosing syringes | Braun | 9161406V | OGTT/ITT |
| Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm) | Braun | 304000 | ITT; lean mice |
| Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm) | Braun | 4657705 | ITT; mice on HFD |
| 96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible | Braintree Scientific, Inc. | SP0016 | OGTT |
| Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit | Crystam Chem | 90080 | OGTT |
| Rodent Diet with 60% kcal% fat | Research Diets Inc | D12492 | mice on HFD |
| Rodent Diet with 10% kcal% fat. | Research Diets Inc | D12450B | mice on LFD |
| BRAND micro haematocrit capillary | Sigma-Aldrich | BR749321 | OGTT/ITT |
| Vaseline – creme | Riviera | P1768677 | OGTT/ITT |
References
- Qatanani, M., Lazar, M. A. Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu. Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).
- Wilcox, G. Insulin and insulin resistance. Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).
- Reaven, G. M. Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).
- Kahn, B. B. Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance. Cell. 92 (5), 593-596 (1998).
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).
- Odegaard, J. I., Chawla, A. Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis. Science. 339 (6116), 172-177 (2013).
- Srinivasan, K., Ramarao, P. Animal models in type 2 diabetes research: an overview. Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).
- Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).
- Winzell, M. S., Ahren, B. The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes. 53, S215-S219 (2004).
- Ayala, J. E., et al. Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice. Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).
- Jais, A., et al. Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man. Cell. 158 (1), 25-40 (2014).
- Teperino, R., et al. Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat. Cell. 151 (2), 414-426 (2012).
- Cresto, J. C., et al. Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice. Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).
- First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. Removal of blood from laboratory mammals and birds. Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).
- McGuill, M., Rowan, A. Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques. ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).
- Hoff, J. Methods of Blood Collection in the Mouse. Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).
- Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).
- Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).
- Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice. Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).
- Pelleymounter, M. A., et al. Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice. Science. 269 (5223), 540-543 (1995).
- Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
- Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers. Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).
- Bailey, C. J., Flatt, P. R. Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice. Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).
- Shi, H., et al. Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).
- Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics. Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).
- Kohsaka, A., Bass, J. A sense of time: how molecular clocks organize metabolism. Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).
- Drucker, D. J. Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls. Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).
- Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. Evaluating the glucose tolerance test in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).
- Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice. J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).
- Bowe, J. E., et al. Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models. J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).
- Arioli, V., Rossi, E. Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice. Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).
- Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. Evaluation of glucose homeostasis. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , 23 (2007).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).
- McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse. Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).
- Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. Methods and models for metabolic assessment in mice. J Diabetes Res. 2013, 986906 (2013).
- Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations. Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).
- Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse. Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).
