Undersøgelse af In Vivo glukosemetabolismen i høj-fedt kost-fed mus bruger Oral glukose Tolerance Test (OGTT) og Insulin Tolerance Test (ITT)

Summary

Den nuværende artikel beskriver generation og metaboliske karakterisering af højt fedtindhold kost-fed mus som en model af kost-induceret insulinresistens og fedme. Det har yderligere detaljerede protokoller for at udføre oral glukose tolerance test og insulin tolerance test, overvågning hele kroppen ændringer af glukose stofskifte i vivo.

Abstract

Fedme repræsenterer den vigtigste enkelte risikofaktor i patogenesen af type 2 diabetes, en sygdom, som er karakteriseret ved en resistens over for insulin-stimuleret glukoseoptagelse og en grov dekompensation af systemisk glukosemetabolismen. Trods betydelige fremskridt i forståelsen af glukose metabolisme forbliver de molekylære mekanismer i sin forordning i sundhed og sygdom, under-undersøgt, mens nye strategier til forebyggelse og behandling af diabetes er behov for. Kost afledte glukose stimulerer bugspytkirtlen udskillelsen af insulin, som tjener som den vigtigste regulator af cellulære anabolske processer i løbet af fodret tilstand og dermed saldi blodglucose niveauer til at opretholde status som systemisk energi. Kronisk overfeeding udløser meta-betændelse, hvilket fører til ændringer i perifer insulin receptor-associerede signalering og dermed reducerer følsomheden over for insulin-medieret glukose bortskaffelse. Disse begivenheder i sidste ende resultere i forhøjet fastende glukose og insulin niveauer samt en reduktion i glukosetolerance, som igen tjener som vigtige indikatorer for insulinresistens. Vi præsenterer her, en protokol til generation og metaboliske karakterisering af højt fedtindhold kost (HFD)-fodret mus som hyppigt anvendte model af kost-induceret insulinresistens. Vi illustrere detaljeret oral glukose tolerance test (OGTT), som overvåger den perifere bortskaffelse af et oralt administreret glukose belastning og insulin udskillelsen over tid. Derudover præsenterer vi en protokol for insulin tolerance test (ITT) til at overvåge hele kroppen insulin handling. Sammen, repræsenterer disse metoder og deres downstream programmer kraftfulde værktøjer til at karakterisere generelle metabolisk fænotype af mus samt specifikt vurdere ændringer i glukosemetabolismen. De kan være særligt nyttigt i feltet bred forskning af insulinresistens, diabetes og fedme at tilvejebringe en bedre risikoforståelse patogenese samt at teste effekten af terapeutiske indgreb.

Introduction

I den udviklede verden nået fedme og diabetes epidemiske dimensioner på grund af fysisk inaktivitet og overskydende forbrug af forarbejdede fødevarer, effekter, der er drevet af hurtige urbanisering, industrialisering samt globalisering. Selv om forskning på insulinresistens og det er co-morbiditet, såsom hyperlipidæmi og åreforkalkning, har fået fremtrædende plads i de sidste årtier, de komplekse biologiske mekanismer, der regulerer stofskiftet i sundhed og sygdom forblive ufuldstændigt forstået og der er stadig et presserende behov for nye behandlingsmodaliteter at forebygge og behandle disse sygdomme¹.

Insulin, og det er counter-regulatory hormonet glukagon tjene som de vigtigste regulatorer af cellulære energi forsyning og makronæringsstoffer balance, således også opretholde ordentlig systemisk blod glucose koncentrationer². Glukose, selv fungerer som en af de vigtigste stimulatorer af insulinsekretion af pancreas β-celler, mens andre makronæringsstoffer, humorale faktorer samt neurale input yderligere redigere responset. Insulin udløser derfor tilstanden fodret anabolske processer ved at lette udbredelsen af overskydende blodglukose i muskel, og fedtceller og yderligere aktivering glykolyse samt protein- eller fedtsyresyntese, henholdsvis. Derudover undertrykker insulin nedsat glukose output ved at hæmme glukoneogenese. Kronisk overskydende energiforbrug og meta-betændelse fører til hyperinsulinemia og perifer insulinresistens på grund af ned-reguleringen af insulin receptor udtryk samt ændringer i downstream signaling veje, hvilket resulterer i nedsat følsomhed over for insulin-medieret glukose bortskaffelse samt utilstrækkelig hæmning af hepatisk glucose produktion^3,4,5,6.

En lang række dyremodeller med genetiske, ernæringsmæssige eller eksperimenterende induktion af sygdommen har vist sig for at være fremragende værktøjer til at studere de molekylære mekanismer af insulinresistens og forskellige former for diabetes samt dets ledsagende sygdomme⁷ . Et godt eksempel er den udbredte og veletablerede HFD-induceret musen model, som er karakteriseret ved hurtig vægtøgning på grund af øget indtagelse i kombination med reduceret metaboliske effektivitet, hvilket resulterer i insulin resistens^{8, 9}. både i dyremodeller og mennesker, en opstemthed i fastende glukose og insulin i blodet, samt en nedsat tolerance for glucose administration er hyppigt anvendte indikatorer for insulinresistens og andre systemiske ændringer af glucose metabolisme. Overvågning glukose og insulin i blodet til basal tilstand eller efter stimulation er derfor lettilgængelige udlæsninger.

Denne protokol beskriver generation af HFD-fed mus samt to ofte anvendte metoder, oral glukose tolerance test (OGTT) og insulin resistens test (ITT), som er nyttige at karakterisere metabolisk fænotype og undersøge ændringer i glukosemetabolismen. Vi beskriver OGTT i detaljer, som vurderer bortskaffelse af et oralt administreret glukose belastning og insulin udskillelsen over tid. Yderligere, vi give anvisninger på hvordan man fører ITT for at undersøge hele kroppen insulin-indsats ved at overvåge blod glukose koncentration som svar på en bolus insulin. De protokoller, der er beskrevet i denne artikel er veletableret og har været brugt i flere studier^10,11,12. Ud over mindre ændringer, som kan bidrage til at øge succes, leverer vi retningslinjer for eksperimenterende design og dataanalyse såvel som nyttige hints undgå potentielle faldgruber. De protokoller, der er beskrevet heri kan være meget effektive værktøjer til at undersøge genetiske, farmakologiske, kosten og andre miljømæssige faktorer indflydelse på hele kroppen glukosemetabolismen og dens tilknyttede lidelser såsom insulinresistens. Ud over stimulation med glukose eller insulin, kan en række andre forbindelser anvendes til stimulation afhængigt af formålet med individuelle forskning. Selv om uden for anvendelsesområdet for dette manuskript, kan mange andre downstream applikationer udføres på de tegnede blodprøver, som analysen af blodværdier end glukose og insulin (fx, lipid og lipoprotein profiler) samt detaljerede analyse af metaboliske markører (f.eks.ved kvantitative realtid Polymerase Chain Reaction (PCR), Western blot analyse og Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)). Yderligere flow flowcytometri og fluorescens aktiveret celle sortering (FACS) kan anvendes til at undersøge effekter i forskellige enkelt cellepopulationer, mens transkriptom, proteom og metabolomic tilgange kan også udnyttes for målrettede analyse.

Samlet set, vi leverer en enkel protokol for at generere en HFD-induceret musemodel, mens yderligere beskriver to kraftfulde tilgange til at undersøge hele kroppen stofskifteforandringer, OGTT og ITT, som kan være nyttige værktøjer til at studere sygdomme patogenese og udvikle nye behandlingsformer, især med hensyn til metabolisme-associerede sygdomme som insulinresistens og diabetes.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af Animal Care og brug Udvalget af det medicinske universitet i Wien og udført ifølge den Føderation af europæiske laboratorium animalsk videnskab foreninger (FELASA). Venligst udføres Bemærk at alle procedurerne i denne protokol bør kun efter institutionel og statslig godkendelse samt personale, der er teknisk dygtige. 1. HFD-fed mus Bemærk: Fastholde alle C57BL/6J mus på en 12-h lys/mørke cyklus med fri adgang…

Representative Results

Figur 1 viser et skematisk tidsplan for metaboliske fænotyper af mus på kost. I en alder af ca. 6 uger, mus, skal placeres på en HFD, mens en LFD-gruppen kan tjene som kontrolgruppen. Vigtigere, bør legemsvægt bestemmes ugentligt at observere, hvis der er en forventet stigning i kropsvægt. Enhver form for stress (fx, støj eller aggressive mandlige adfærd) kan forstyrre kroppens vægtøgning og bør fjernes straks. Hver kohorte af mus til kost…

Discussion

Med den høje forekomst af diabetes og tilknyttede sygdomme i verdens befolkning er der et stærkt krav om forskning, der tager den molekylære mekanisme, forebyggelse og behandling af sygdom¹⁹. Den præsenterede protokol beskriver veletablerede metoder for generation af HFD mus, en robust dyremodel bruges til metaboliske forskning samt overledning af OGTT og ITT, som er potent værktøj til vurdering af hele kroppen stofskifteforandringer såsom insulinresistens. De metoder, der præsenteres i de…

Materials

Mouse strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	LFD/HFD
Accu Chek Performa – Glucometer	Roche	6870228	OGTT/ITT
Accu Chek Performa – Strips	Roche	6454038	OGTT/ITT
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	OGTT
Actrapid – Insulin	Novo Nordisk	417642	ITT
Reusable Feeding Needles	Fine Science Tools	#18061-22	OGTT; 22 gauge (-24 gauge for young mice)
Omnifix-Fine dosing syringes	Braun	9161406V	OGTT/ITT
Sterican Insulin needle (30G x 1/3"; ø 0.30 x 13 mm)	Braun	304000	ITT; lean mice
Sterican (G 27 x 3/4"; ø 0.40 x 20 mm)	Braun	4657705	ITT; mice on HFD
96 Well PCR Plates, non-skirted, flexible	Braintree Scientific, Inc.	SP0016	OGTT
Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA kit	Crystam Chem	90080	OGTT
Rodent Diet with 60% kcal% fat	Research Diets Inc	D12492	mice on HFD
Rodent Diet with 10% kcal% fat.	Research Diets Inc	D12450B	mice on LFD
BRAND micro haematocrit capillary	Sigma-Aldrich	BR749321	OGTT/ITT
Vaseline – creme	Riviera	P1768677	OGTT/ITT