Bruker CRISPR/Cas9 Gene redigering for å undersøke kreftfremkallende aktiviteten av muterte Calreticulin i cytokin avhengige blodkreft cellene
Summary
Målrettet genet redigering med CRISPR/Cas9 har mye lettere forståelsen av biologiske funksjoner gener. Her bruker vi CRISPR/Cas9 metodikken å modell calreticulin mutasjoner i cytokin-avhengige blodkreft cellene for å studere aktiviteten deres kreftfremkallende.
Abstract
Gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) er en adaptiv immunitet system i prokaryoter som har blitt repurposed av forskere å generere RNA-guidede nucleases, som CRISPR-assosiert (Cas) 9 for områdespesifikke eukaryote genom redigering. Genomet engineering av Cas9 brukes effektivt, enkelt og robust endre endogene gener i mange biomedically relevante pattedyr linjer og organismer. Her viser vi et eksempel på hvordan å utnytte CRISPR/Cas9-metodikk for å forstå de biologiske funksjonen av bestemte genetiske mutasjoner. Vi modellen calreticulin (CALR) mutasjoner i murine interleukin-3 (mIL-3) underordnede pro-B (Ba/F3) celler ved levering av enkelt guide RNAs (sgRNAs) målretting endogene Calr locus i den spesifikke regionen der innsetting og/eller sletting (indel ) CALR mutasjoner oppstår i pasienter med myeloproliferative neoplasms (MPN), en type blodkreft. SgRNAs opprette dobbel-strand bryter (DSBs) i det målrettede området er reparert av ikke-homologe slutten med (NHEJ) for å gi indeler i ulike størrelser. Vi bruker deretter standard Ba/F3 mobilnettet transformasjon analysen å forstå effekten av fysiologiske nivå uttrykk for Calr mutasjoner på blodkreft mobilnettet transformasjon. Denne tilnærmingen kan brukes på andre gener å studere deres biologisk funksjon i ulike pattedyr linjer.
Introduction
CRISPR/Cas9-teknologien har nylig revolusjonert målrettet genomet redigering i levende celler og organismer. Det har blitt en svært kraftig verktøy for biomedisinsk forskning og er for tiden brukes som en potensiell avenue for behandling av genetiske sykdommer1. Grunnlaget for alle genomet redigeringsverktøy er avhengig av etableringen av en nuclease-indusert DNA dobbel strandet pause (DSB) på genomisk locus endres. DSBs kan repareres av ikke-homologe slutten begynte (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)2,3. Fordelen med den Cas9 nuclease over andre genomet engineering nucleases, som sink finger nucleases (ZFNs) og transkripsjon aktivator som effektor nucleases (TALENs) er sin avhengighet av RNA for målretting nuclease til en ønsket DNA sekvens, sammenlignet til protein-DNA samhandlingene i ZFNs og TALENs2,3.
Etter oppdagelsen av CRISPR/Cas9 nuclease veien som en adaptive immunsystemet i prokaryote celler4,5gått mye arbeid inn tilpasse veien for bruk i pattedyr linjer og modell organismer2, 3. som et verktøy for redigering av genet, CRISPR/Cas9 veien benytter to hovedkomponenter: Streptococcus pyogenes (Sp) avledet Cas9 nuclease og sgRNAs rettet mot genet av interesse2,3. SgRNA består av 20 nukleotider som direkte Cas9 for et bestemt område på genomet til RNA-DNA base par komplementaritet2,3. Målområdet for sgRNA må være tilstøtende til et protospacer tilstøtende motiv (PAM) i form av 5′ NGG, som er anerkjent av SpCas9 nuclease. Med disse verktøyene kan Cas9 rettes til noen DNA sekvensen ved å designe sgRNAs som mål regionen rundt. I tillegg til Sp avledet Cas9, er det flere varianter av Cas9 med forskjellige funksjoner avhengig av det bestemte programmet. For eksempel finnes det Cas9 varianter med høyere spesifisitet for på målet redigering eller single-strand cleavage kapasitet for DNA skår6,7. Videre er katalytisk inaktive Cas9 nylig utviklet for transcriptional regulering8. Forskere har brukt CRISPR/Cas9 systemet til en rekke programmer, for eksempel genet knockin og knockout å studere biologiske funksjonene gener9, tap av funksjon og gevinst-av-funksjon bibliotek skjermer10 og genetisk utvikling av modell organismer11.
I denne protokollen kombineres CRISPR/Cas9 metodikken med Ba/F3 mobilnettet transformasjon analysen å forstå biologisk funksjon CALR mutasjoner. Ba/F3 cellene er en murine IL-3 underordnede blodkreft cellen linje som kan gjengis IL-3 uavhengig på uttrykk for visse oncogenes som BCR-ABL12. For å forstå om mutant calreticulin kan forvandle Ba/F3 celler cytokin uavhengig vekst, vi målrettet ekson 9 av endogene Calr locus bruker CRISPR/Cas9 for å innføre indel mutasjoner og deretter trakk IL-3 fra cellene gjelder et positiv utvalg press, med mål om recapitulating gevinst-av-funksjon CALR mutasjoner i MPN pasienter. Protokollen inneholder design, kloning og levering av sgRNAs, utviklingen av stabile Cas9 uttrykke celler og screening for CRISPR på målet genet redigering. Dette kan brukes på ulike gener og ulike cytokin-avhengig cellelinjer rundt og er spesielt nyttig i modellering og studere biologiske funksjonen i gener involvert i kreft.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her viser vi bruk av CRISPR/Cas9 gene redigering for å studere biologiske funksjon CALR mutasjoner i blodkreft cellene. Suksessen til denne protokollen er svært avhengig av flere faktorer. Først er det viktig å vite hvilke typer mutasjoner kan være ansvarlig for fenotypen som er ønsket. I denne protokollen, readout er transformasjonen av Ba/F3 celler til mIL-3 uavhengighet og de mutasjoner er indeler i ekson 9 i CALR. Men hvis ønsket mutasjon er en enkelt base par substitusjon, er HDR-mediert rep…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01HL131835), en Damon Runyon kliniske etterforsker award og Starr kreft konsortiet.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
