Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Published: January 5, 2018 doi: 10.3791/56726
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Division of Hematology, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Broad Institute, 3Dana-Farber Cancer Institute, Harvard Medical School

Summary

Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.

Abstract

Geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) is een adaptieve immuniteitssysteem in prokaryoten dat heeft geweest voorzien door wetenschappers voor het genereren van RNA-geleide nucleasen, zoals CRISPR-geassocieerde (Cas) 9 voor site-specific eukaryotische genoom bewerken. Genoom techniek door Cas9 wordt gebruikt voor het efficiënt, gemakkelijk en krachtig wijzigen endogene genen in vele biomedically relevante zoogdieren cellijnen en organismen. Hier laten we een voorbeeld van het gebruik van de methodologie van de CRISPR/Cas9 om te begrijpen van de biologische functie van specifieke genetische mutaties. We calreticulin (CALR) mutaties in lymfkliertest interleukine-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) doelcellen model door levering van één gids RNAs (sgRNAs) gericht op de endogene Calr locus in de specifieke regio waar inbrengen en/of schrapping (indel ) CALR mutaties optreden bij patiënten met myeloproliferatieve gezwellen (MPN), een soort bloedkanker. Dubbele strand einden (DSBs) maken de sgRNAs in het gerichte gebied dat worden gerepareerd door niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) zodat microdeleties van verschillende grootte. We gebruiken dan de standaard Ba/F3 cellulaire transformatie bepaling te begrijpen van het effect van fysiologische niveau expressie van mutaties van de Calr op hematopoietische cellulaire transformatie. Deze aanpak kan worden toegepast op andere genen te bestuderen van hun biologische functie in verschillende zoogdieren cellijnen.

Introduction

CRISPR/Cas9 technologie heeft onlangs een revolutie teweeggebracht in het bewerken van gerichte genoom in levende cellen en organismen. Het is uitgegroeid tot een zeer krachtig hulpmiddel voor biomedisch onderzoek en wordt momenteel gebruikt als een potentiële avenue voor behandeling van genetische ziekten1. De basis voor alle genoom bewerkingsgereedschappen steunt op de oprichting van een nuclease-geïnduceerde DNA dubbele gestrande pauze (DSB) aan de genomic locus worden gewijzigd. De DSBs kunnen worden gerepareerd door niet-homologe einde-lid te worden (NHEJ) of homologie geleide reparatie (HDR)2,3. Het voordeel van de Cas9 nuclease over andere genoom engineering nucleasen, zoals zink vinger nucleasen (ZFNs) en de transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs) is de afhankelijkheid van RNA voor het targeten van de nuclease naar een gewenste opeenvolging van DNA, vergeleken om de eiwit-DNA interacties gevonden in ZFNs en TALENs2,3.

Na de ontdekking van de CRISPR/Cas9 nuclease traject als een adaptieve immuunsysteem in prokaryotische cellen4,5, is veel moeite besteed aan de aanpassing van het traject voor gebruik in zoogdieren cellijnen en model organismen2, 3. als een hulpmiddel voor het bewerken van het gen, de CRISPR/Cas9-pathway maakt gebruik van twee hoofdonderdelen: de Streptococcus pyogenes (Sp) afgeleid Cas9 nuclease en sgRNAs gericht op het gen van belang2,3. De sgRNA bestaat uit 20 nucleotiden die directe Cas9 naar een specifieke site op het genoom door RNA-DNA basenpaar complementariteit2,3. De doelsite van de sgRNA moet liggen naast een protospacer aangrenzende motief (PAM) in de vorm van 5' NGG, die is erkend door de SpCas9 nuclease. Met deze tools kan Cas9 worden omgeleid naar een DNA-sequentie door het ontwerpen van sgRNAs dat doel de regio van belang. Daarnaast Sp afgeleid Cas9, zijn er extra varianten voor Cas9 met verschillende functies afhankelijk van de specifieke toepassing. Er zijn bijvoorbeeld Cas9 varianten met hogere specificiteit voor het bewerken van de aan de doelsoort of single-strand decollete capaciteit voor DNA plukt6,7. Bovendien is onlangs catalytically inactieve Cas9 ontwikkeld voor transcriptionele voorschrift8. Wetenschappers hebben nu de CRISPR/Cas9-systeem gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen, zoals gene knockin en knock-out te bestuderen van de biologische functies van genen9, verlies-van-functie en winst-van-functie bibliotheek schermen10 en genetische Engineering van model organismen11.

In dit protocol combineren we de methodologie van de CRISPR/Cas9 met de bepaling van de cellulaire transformatie Ba/F3 te begrijpen van de biologische functie van CALR mutaties. BA/F3 cellen zijn een lymfkliertest IL-3 hematopoietische doelcel lijn die kan worden gerenderd IL-3 onafhankelijke op expressie van bepaalde oncogenen zoals BCR-ABL12. Om te begrijpen of mutant calreticulin Ba/F3 cellen cytokine onafhankelijke groei kan transformeren, we gericht exon 9 van de endogene Calr locus met behulp van CRISPR/Cas9 te voeren indel mutaties en trok vervolgens IL-3 uit de cellen toe te passen een positieve selectiedruk, met als doel Recapitulerend winst-van-functie CALR mutaties gevonden in MPN patiënten. Het protocol bevat het ontwerp, het klonen en de levering van sgRNAs, de ontwikkeling van stabiele Cas9 waarin cellen en screening voor CRISPR op doelsoort gene bewerken. Dit protocol kan worden toegepast op verschillende genen en verschillende cytokine-afhankelijke cellijnen van belang en is vooral waardevol in modellering en het bestuderen van de biologische functie van genen betrokken bij kanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sgRNA Design met behulp van Online Tools13

  1. Ontwerp sgRNAs gericht op het gen van belang met behulp van vrij beschikbare online tools.
    1. Kopieer en plak de NCBI referentie sequentie van het gen van belang in de brede Instituut sgRNA designer webtool: (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      Opmerking: Dit hulpprogramma identificeert sgRNA sequenties met decollete sites binnen exons en degenen die zich uitstrekken over de intron/exon grens maar nog steeds binnen de exon klieven.
    2. Download en open het uitvoerbestand van tekst in excel.
    3. Focus op de kolommen gevuld met de sequenties van de sgRNA en de sgRNA context sequenties. Merk op dat de sgRNA-sequenties niet het protospacer aangrenzende motief (PAM bevatten), maar de context sequenties doen.
    4. Merk op dat de score op de doelsoort werkzaamheid lijsten de voorspelde decollete efficiëntie score op een schaal van 0 tot 1 waar een score van 1 duidt op een hogere efficiëntie van de splitsing.
    5. Gebruik de 'soort'-functie van excel om ofwel de doelstellingen door de score van de werkzaamheid of door de locatie in het gen van het doel via de kolom 'Target Cut %'.
      Opmerking: Sorteren op locatie binnen het gen is handig voor het identificeren van sgRNAs die gericht zijn op een specifiek domein of exon van belang.
    6. Selecteer 3-6 sgRNAs die gericht zijn op het gebied van belang met hoge (> 0,6) op doelsoort zijn werkzaamheid scores. Op annuleerteken zitten nuttig om te weten wat voor soort mutaties mogelijk verantwoordelijk voor het fenotype dat gewenste (Zie Figuur 1 verklaren de targeting strategie voor calreticulin gebruikt).
      Opmerking: sgRNAs onder de voorgestelde drempel van de score van de 0.6 werkzaamheid moet worden overwogen als er een gebrek aan andere goede kandidaten.
    7. Gebruik de webtool voor MIT gRNA analyse naar scherm voor potentiële af-target effecten (http://crispr.mit.edu/). Voor elke sgRNA geselecteerd, voert u de volgorde van de doelgroep (met inbegrip van de PAM).
      Opmerking: De brede Instituut sgRNA designer webtool kan ook worden gebruikt aan het scherm voor off-target effecten (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
      1. Merk op dat het analysehulpprogramma voor MIT sgRNA elk sgRNA scoort op een schaal van 1-100 waar een score van 100 geeft hogere specificiteit. Een score groter dan 70 is ideaal en vertegenwoordigt een sgRNA met minimale uit-target effecten. Deze website genereert ook een lijst van uit-target hits met hun locatie binnen het genoom en hoeveel incongruenties hebben zij elk met de kandidaat-gids.
        Opmerking: Off-target hits met vier incongruenties of meer worden beschouwd als veilige14. Af-target hits met minder dan vier incongruenties mogelijk problematisch als ze binnen exons14 vallen.
    8. Kies 2-3 sgRNAs die richten op verschillende locaties in de regio van belang zijn voor het doel-gen, en die hebben de hoogste scores voor gepaarde decollete efficiëntie en af-target (Zie tabel 1 voor sgRNA opeenvolgingen richten exon 9 van Calr).
      Opmerking: Afhankelijk van de experimentele doelen, meer nadruk kan worden gelegd op de verschillende waarden, verkregen uit de genoemde instrumenten.

2. klonen sgRNA Oligos13

  1. Genereren van de voorwaartse oligo
    1. Maak een lijst van sgRNA opeenvolgingen zonder de PAM-site.
    2. Een G toevoegen aan het einde 5' van de reeks als het 5' einde van de reeks van de sgRNA niet een G. is
      Opmerking: Deze G is nodig voor het maximaliseren van U6-gedreven sgRNA transcriptie niveau. Toevoeging van een G is nodig voor m1 sgRNA (tabel 1).
    3. De reeks "CACC" toevoegen aan het einde 5' van de G-geoptimaliseerde gids sequentie (geen PAM) (tabel 2) om het genereren van de overhangen vereist voor afbinding van ontharde oligos in BsmBI lentiGuide vector verteerd (zie stap 3).
  2. Genereren van de omgekeerde oligo
    1. Omgekeerde als aanvulling op de G-geoptimaliseerde gids sequentie (geen PAM).
    2. De reeks "AAAC" toevoegen aan het einde 5' van de omgekeerde aangevuld G-geoptimaliseerde gids volgnummer (tabel 2).
    3. De ontworpen oligos van een primer synthese bedrijf bestellen
  3. Anneal en phosphorylate van oligos
    1. Voeg 1 µL van voorwaartse oligo (100 µM), 1 µL van omgekeerde oligo (100 µM), 1 µL van 10 x T4 afbinding buffer, 0,5 µL van T4 polynucleotide kinase (PNK) en 6.5 µL van H2O van de buis van een PCR (totaal = 10 µL).
    2. Het volgende programma uitvoeren in de thermocycler: 37 ˚C voor 30 min, 95 ˚C voor 5 min, helling van 95 tot en met 25 op 0.1 ° C/s.
    3. Verdun het reactieproduct op 1:250 in H2O.

3. vertering van lentiGuide-Puro Vector13

  1. Digest lentiGuide-Puro vector
    1. Monteren van een 50 µL spijsvertering reactie met de volgende onderdelen: 5 µg circulaire plasmide, 2 µL (30 eenheden) van BsmBI restrictie-enzym, 5 µL van het restrictie-enzym buffer en maximaal 50 µL van H2O.
    2. De reactie voor 2 h uitvoeren bij 55 ° C. Na het eerste uur, voeg 1 µL meer van restrictie-enzym BsmBI toe.
  2. Dephosphorylate de gesneden ruggengraat
    1. 7 µL van fosfatase reactie buffer en 2 µL van fosfatase-enzym toevoegen aan de verteerd vector.
    2. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  3. PCR zuiveren de knippen en gedefosforyleerd ruggengraat met behulp van een commerciële kit.
    Opmerking: Plaatsvervanger de verstrekte roze gekleurde kolommen met de miniprep kit blauw gekleurde kolommen omdat deze beter geschikt voor grote plasmide maten. De opbrengst kan worden verhoogd door verwarming van de elutie buffer in een 90 ˚C warmte blok vóór elutie en eluerende het DNA uit de kolom twee keer aan het einde (de eluted DNA vanuit de eerste elutie terug door een tweede keer uitgevoerd).

4. afbinding ofAnnealed Oligos in verteerd Backbone13

  1. Voeg 50 ng van verteerd backbone, 1 µL van gegloeid oligo verdunning, 1 µL van 10 x T4 afbinding buffer, 1 µL van T4 ligase en maximaal 10 µL van H2O van een PCR-buis. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur
  2. Transform Stbl3 cellen met 2 µL van de afbinding reactie. Plaat op een lysogenie Bouillon (LB) agar bord met 100 µg/mL ampicilline en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.
  3. Kies 3 kolonies en enten in een mini prep-cultuur.
  4. Valideren van juiste oligo invoegen
    1. Een miniprep voor elke cultuur en volgorde via de oligo invoeging site vanaf een primer in de promotor van de U6 met behulp van een commerciële kit uitvoeren
    2. Een midi-prep- of een maxi-voorbereiding van de reeks-geverifieerd cultuur uitvoeren.

5. generatie van cel lLines stabiel uiting van SpCas9

Opmerking: Dit protocol omvat de levering van pLX_TRC311-Cas9-plasmide door lentivirale infectie. Dit protocol wordt beschreven in detail voor lymfkliertest interleukine-3 (mIL-3) pro-B (Ba/F3) doelcellen, een cellijn van schorsing en kan worden aangepast aan andere soorten van de cellen met de gewenste cultuur voorwaarden voor elk celtype. Het kweekmedium voor Ba/F3 cellen bestaat uit RPMI, aangevuld met de foetale runderserum 10%, 1% penicilline/streptomycine/L-glutamine en 10 ng/mL lymfkliertest interleukine 3.

  1. Transfect HEK-293T cellen
    1. Beënt, 3 x 106 HEK-293T cellen per 10 cm weefselkweek schotel. Geplaatste cellen 's nachts voor Transfectie houden.
      Opmerking: HEK-293T cellen zijn een aanhangend cellijn en worden routinematig gebruikt voor de productie van het virus. De cellen worden bijgehouden in het DMEM aangevuld met de foetale runderserum 10%, 1% penicilline/streptomycine/L-glutamine. Cellen moeten ten tijde van de transfectie 80% heuvels.
    2. Pre warm verminderd serum media (Opti-MEM) en groeimedium.
    3. 500 µL van verminderde serum media, 7 pLX_TRC311-Cas9-construct, 4 µg pCMV-VSV-G lentivirale verpakking plasmide en 4 µg psPAX2 lentivirale verpakking plasmide µg in een buis toevoegen
      Opmerking: Totale DNA per 10 cm schotel van 293T cellen is 15 µg.
    4. Meng het DNA goed en voeg 45 µL van transfectiereagens. Meng voorzichtig en laat het staan voor 20 min.
      Opmerking: Het is belangrijk dat verminderde serum media gebruiken omdat serum de complexe vorming tussen de transfectiereagens en plasmide DNA zal afremmen.
    5. Het oude medium in de 293T plaat gecombineerd en voeg 5 mL van nieuwe groeimedium.
    6. De mix van DNA en transfectie reagens op een verstandige manier van drop aan de plaat van de 293T toevoegen. Swirl zachtjes en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 uur.
    7. Oogst virale supernatant op 24 en 48 h post transfectie. Passeren van een 0,22 µm filter en aliquot in een cryovial buis (1.6 mL/buis en 1,5 mL zal worden gebruikt voor infectie).
    8. Winkel virale supernatant bij-80 ° C.
      Opmerking: lentivirale supernatant kan worden gebruikt binnen 6 maanden. Indien mogelijk, moeten spinfection transductions worden uitgevoerd met verse virus).
  2. Lentivirale infectie van cellen Ba/F3
    1. Ontdooi het virale supernatant op ijs, als bevroren.
    2. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 4 min.
    3. Gecombineerd supernatant en resuspendeer de cellen bij een concentratie van 3 x 106 cellen/mL.
    4. Voeg 500 µL van de geresuspendeerde cellen, 1,5 mL van het supernatans dat virale, 4 µL van polybrene (voorraad: 2 mg/mL) en 10 ng/mL van m-IL3 in een 6-well weefselkweek plaat. Zorg ervoor dat een niet-geïnfecteerde goed met 1,5 mL media in plaats van virale bovendrijvende substantie als een besturingselement.
      Nota: Het bedrag van virale bovendrijvende substantie toegevoegd moet overeenkomen met een veelheid aan infectie (MOI) < 1.
    5. Centrifugeer de plaat bij 440 x g gedurende 120 minuten bij 37 ° C.
    6. Nemen van de plaat uit de centrifuge en plaats in de 37 ° C en 5% CO2 incubator en laat 's nachts groeien.
    7. Spin down de cellen na 24 h en resuspendeer met 5 mL verse warme media in een 6-well-plate.
  3. Selectie van Cas9 besmette cellen
    1. Spin down de cellen en resuspendeer met verse warme media, aangevuld met 5 µg/mL blasticidin, 48 h post spinfection.
    2. Selecteer de cellen gedurende 9 dagen met blasticidin of totdat niet-geïnfecteerde (negatieve) controle cellen dood zijn.
    3. Nadat de selectie voltooid is, overbrengen in de resistente cellen medium met een lagere concentratie van blasticidin.

6. verslaggever Assay voor Cas9 activiteit15

  1. Transduce ouderlijke cellen en cellen uiten stabiel Cas9 met pXPR-011 door lentivirale infectie (Zie stappen 5.1-5.2).
    Opmerking: Deze vector bevat zowel GFP en een gids GFP targeting. Cellen met actieve Cas9 zal resulteren in een afname van GFP (Figuur 2).
  2. Selecteer de cellen gedurende 3 dagen met 2 µg/mL puromycin, 48 h post spinfection.
  3. Analyseer de monsters voor GFP expressie door stroom cytometry.
    Opmerking: Een GFP-vermindering van 50% of meer vertegenwoordigt optimale Cas9 activiteit. Een hogere concentratie van blasticidin selectie kan worden gebruikt om het verhogen van de Cas9 activiteit als minder dan een korting van 50% wordt waargenomen. Niet alle cellijnen kunnen tolereren blasticidin selectie. In dit geval, kan gebruik van Cas9 vectoren met andere selectie cassettes nodig zijn. Bovendien kunnen niet alle cellijnen stabiele uitdrukking van Cas9 tolereren. In dit geval, kan voorbijgaande transfectie van Cas9 worden gebruikt.

7. Spinfection van sgRNAs in Cas9 uitdrukken van cellen

  1. Stappen 5.1-5.2 voor lentivirale van het sgRNAs in cellen van belang.
    Opmerking: Vervang In stap 5.1.3, pLX_TRC311-Cas9 constructie met de constructie van de lentiGuide-Puro gevalideerd van sectie 4.
  2. 48 h spinfection post, selecteert u de cellen voor 3 dagen met 2 µg/mL puromycin.
  3. De resistente cellen omzetten in medium met een lagere concentratie van antibiotica en blijven selectie nog 4 dagen te voorzien in voldoende bewerken.

8. Ba/F3 cellulaire transformatie en positieve selectie met behulp van de terugtrekking van de m-IL3

Opmerking: Deze test is beschreven voor de doelcellen Ba/F3 voor mIL-3 maar kon worden toegepast op elke regel van de afhankelijke cel cytokine.

  1. Spin down exponentieel groeit Ba/F3 cellen ectopically uiten van Cas9 en de sgRNA van belang.
  2. Gecombineerd supernatant en wassen van de cellen met 5 mL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Spin down de cellen en herhaal de stap wassen in 8.2 viermaal (deze stap zorgt u ervoor dat de media is gratis voor IL-3).
  4. De PBS gecombineerd en resuspendeer de cellen in 5 mL verse media zonder IL-3.
  5. Met behulp van een hemocytometer of een cel levensvatbaarheid analyzer cellen tellen.
  6. Zaad cellen in drievoud in een 6-well weefselkweek plaat duikt met een concentratie van 1 x 105 cellen/mL in een totaal volume van 2 mL verse media zonder IL-3.
  7. Toezicht op en de cellen tellen om de 2 dagen voor een totaal van 8 dagen.
    Opmerking: Ba/F3 cellen ontbreken van IL-3 meestal sterven 2 dagen post IL-3 honger. Het is belangrijk om een negatieve controle onder de bepaling (meestal een niet-targeting gids als een besturingselement wordt gebruikt).

9. screening voor het bewerken van CRISPR-On-target

  1. Ontwerpen van CRISPR screening inleidingen bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de breukzijde van de sgRNA
    Opmerking: gebruik inleidingen ten minste 100 bp van de voorspelde breukzijde om detectie zou niet worden beïnvloed door een grote inbrengen en/of schrapping (indel) op de doelsite sgRNA.
  2. Isoleer genomic DNA (gDNA) uit getransformeerde cellen (aan het einde van de groeicurve) en uit cellen pre-cytokine terugtrekking.
    Opmerking: Altijd voorzien van cellen de niet-targeting gids als een besturingselement voor het bewerken van gen overexpressing. GDNA uit cellen isoleren vóór en na transformatie zal identificeren van de klonen die positief waren geselecteerd voor en een proliferatieve voordeel hebben.
  3. Monteren van een 50 µL PCR met de volgende onderdelen: 25 µL van 2 x PCR-mix, 1 µL van voorwaartse primer (10 µM), 1 µL van omgekeerde primer (10 µM), 50-100 ng van gDNA en H2O tot 50 µL.
    Opmerking: Talrijke HiFi-polymerase kunnen worden gebruikt in stap 9.3.
  4. Voorbeelden uitvoeren in een thermocycler met behulp van de volgende parameters: 95° C gedurende 1 minuut, 30 cycli van (94 ° C gedurende 1 min, 52 ° C gedurende 30 s, 72 ° C gedurende 30 s), en 72 ° C gedurende 10 minuten. Deze PCR is geoptimaliseerd voor de inleidingen van de Calr vermeld in tabel 3. Optimaliseren van PCR voorwaarden voor de primer paar ontworpen in stap 9.1 op basis van het testen op gDNA.
  5. 5 µL van de monsters worden uitgevoerd op een 2% agarose gel op 10 V/cm met behulp van 1 x Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer. Onderzoeken van de monsters voor de aanwezigheid / afwezigheid van een versterkte band overeenkomt in grootte tot het gen van belang.
  6. De rest van de PCR-reactie (45 µL) gebruiken voor het uitvoeren van een PCR-zuivering.
  7. Kloon de waarbij met een PCR klonen kit in een plasmide-vector. Bijvoorbeeld worden pGEM T-gemakkelijk vectoren meestal gebruikt.
  8. Het plasmide omvormen van Stbl3 cellen of andere compatibele cellen en plaat op LB agar borden met de relevante antibioticum. Selecteer 10-20 kolonies, mini prep elkaar, en elk kloon onverminderd Sanger sequencing te karakteriseren de microdeleties gemaakt op basis van het bewerken van CRISPR/Cas9.
    Opmerking: Indien gewenst, eencellige fluorescentie geactiveerd cel die sorteren (FACS) kan worden uitgevoerd op de bulk bewerkt bevolking een kloon met een specifieke indel isoleren. Bovendien kan volgende generatie sequencing (NGS) methoden worden gebruikt om meer krachtig kwantificeren op doelsoort bewerken met behulp van diepe rangschikken van PCR waarbij verspreid over de regio van de target sgRNA. Bijvoorbeeld, kan bijhouden van microdeleties door ontleding of tij worden gebruikt in plaats van subcloning precies bepalen het spectrum en de frequentie van gerichte mutaties gegenereerd in een pool van cellen (https://tide.nki.nl/#about)16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de methode beschreven hier, is het doel van dit experiment het bestuderen van de functionele gevolgen van de invoering van indel mutaties aan de endogene locus Calr op hematopoietische Celtransformatie. De CRISPR/Cas9-systeem is gebruikt als een instrument om endogene Calr mutaties in Ba/F3 cellen. Twee sgRNAs werden gekozen te richten exon 9 van Calr (Figuur 1), in de regio waar invoegingen en/of schrapping (indel) mutaties meestal in CALRvoordoen-mutant MPN patiënten17,18. De eerste sgRNA (m1) werd gekozen op basis van haar hoge decollete efficiëntie en gunstige af-target scores (tabel 1). De tweede sgRNA (m2) werd gekozen voornamelijk voor haar locatie in exon 9 en bij gebrek aan extra sgRNAs in de regio om te bewerken met hoge decollete efficiëntie en gunstige af-target scoort (tabel 1). Twee verschillende sgRNAs (m1 of m2) werden gebruikt in afzonderlijke infecties om ervoor te zorgen dat de waargenomen effecten te wijten aan op-target gene bewerken waren. Af-target effecten zijn waarschijnlijk worden gedeeld door meerdere onafhankelijke sgRNAs. De controle van niet-targeting (scramble) werd ook gebruikt als een negatieve controle. Aanwerving van de Cas9 endonuclease te Calr exon 9 wordt DSBs maken bij deze locus voorspeld. De DSBs zou vervolgens worden gerepareerd door NHEJ, die microdeleties van variabele grootte (Figuur 1 genereren kan).

Ontwikkeling van de in vitro CRISPR/Cas9 systeem in Ba/F3 cellen, werden cellen stabiel het uitdrukken van het eiwit Cas9 gemaakt door lentivirale-gemedieerde transductie volgens het protocol zoals hierboven beschreven. Stabiele Cas9 expressie resulteert in robuuste Cas9 activiteit. Cas9 activiteit in Ba/F3-Cas9 cellen werd gemeten door pXPR-011, een verslaggever constructie die zowel GFP en een gids targeting GFP15bevat. Cellen met actieve Cas9 zal resulteren in een afname van GFP15. GFP werd gemeten in de cellen met behulp van stroom cytometry. BA/F3-Cas9 cellen weergegeven een vermindering van ongeveer 76% in GFP, overeenkomt met de robuuste Cas9 activiteit (Figuur 2).

Typ 1 cytokine receptoren, zoals de thrombopoietin receptor (MPL), de Erytropoëtine receptor (EPOR) en de granulocyt kolonie-stimulerende factor receptor (G-TSFR) werden elk individueel, stabiel uitgedrukt in Ba/F3-Cas9 cellen om te bepalen hun Allosterie met mutant calreticulin in transformatie van Ba/F3 cellen te induceren. Transductie van de sgRNA constructies (m1, m2 of een scramble (niet-targeting gids)) werd toen uitgevoerd in elk van de Ba/F3 cellijnen stabiel uiting van Cas9 en de receptor van belang. Cellen werden vervolgens geselecteerd voor 7 dagen met puromycin zodat voldoende tijd voor het bewerken van CRISPR/Cas9-gen. Een positieve selectiedruk werd vervolgens toegepast door honger van de cellen van cytokine (mIL-3). Het doel van deze honger druk is om te identificeren als microdeleties in Calr exon 9, vergelijkbaar zijn met die waargenomen bij patiënten die MPN, zijn geselecteerd, wat resulteert in cytokine-onafhankelijke groei en transformatie van Ba/F3 cellen. De groeicurve werd uitgevoerd voor een totaal van 8 dagen en de cellen om de 2 dagen werden geteld voor het meten van hun transformatie (Figuur 3)19. Cel pellets voor genomic DNA-extractie werden verzameld vóór het begin van de groeicurve en aan het einde van de groeikromme om te controleren of aan de doelsoort bewerken en om te controleren de microdeleties die uitgebreid post cytokine honger (Figuur 3)19.

Cytokine onafhankelijke groei werd waargenomen in Calr-Ba/F3-MPL-Cas9 cellen (figuur 4B), maar niet Calrgericht-ouderlijke Ba/F3-Cas9 cellen (figuur 4A) gericht, of Ba/F3-Cas9 cellen uiten ectopically EPOR (figuur 4C ) of G-TSFR (Figuur 4 d)19. Om te bevestigen dat mIL-3 onafhankelijke groei in cellen van de Calr-gerichte Ba/F3-MPL-Cas9 een gevolg was van het op-target gene bewerken, cellen werden gekapt 8 dagen post mIL-3 terugtrekking en genomic DNA was uitgepakte19. Een 422 bp regio verspreid over de doelsite werd versterkt met behulp van de inleidingen die zijn vermeld in tabel 3. Sub-kloont van PCR waarbij werd uitgevoerd en 30 individuele klonen werden gestuurd voor Sanger sequencing. Voor m1 of m2 Calr-gerichte Ba/F3-MPL-Cas9 cellen, alle sub klonen bevatte microdeleties van verschillende grootte op de gewenste gesneden site (Figuur 5)19. 11 van de 13 m1 sub klonen bleken te bevatten microdeleties, die hebben geleid tot + 1 bp frameshift mutaties (Figuur 5), vergelijkbaar met die gevonden in patiënten. Voor m2 Calr-gerichte cellen, 10 van 17 sub klonen bleken te bevatten microdeleties, die hebben geleid tot + 1 bp leesraamverschuiving (Figuur 5)19. Deze gegevens bevestigen dat CRISPR/Cas9-gemedieerde invoering van + 1bp frameshift mutaties aan de endogene Calr exon 9 locus is voldoende om te verlenen oncogene activiteit tot en met Calr19. De gegevens rangschikken in Figuur 5 blijkt ook dat de invoering van heterozygoot + 1bp frameshift mutaties aan de endogene Calr locus is voldoende om te transformeren Ba/F3-MPL cellen, consistent met de opmerking dat CALR mutaties zijn meestal heterozygoot in MPN patiënten17,18. Aangezien NHEJ herstelt resultaten in hoge heterogeniteit tussen de microdeleties, kon eencellige sorteren om te isoleren een kloon van belang worden uitgevoerd. Hierdoor zouden de onderzoeker de effecten van specifieke mutaties gemaakt door CRISPR/Cas9 te bestuderen.

Figure 1
Figuur 1: Schema van de CRISPR/Cas9 gen-bewerken doelgerichtheid van exon 9 van Calr. Twee sgRNAs werden ontworpen om te richten van een site binnen de muis Calr exon 9 regio overeenkomt met die gericht door de + 1bp frameshift mutaties in menselijke MPN (rode balk). Doel sequenties met PAMs (donkerblauw) worden weergegeven, en verwachte sites van splijten door Cas9 worden aangegeven door rode driehoeken. DSBs gegenereerd door CRISPR/Cas9 worden vervolgens gerepareerd door NHEJ, die wordt verwacht voor het genereren van microdeleties van variabele lengte19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Cas9 activiteit assay. Ouderlijke Ba/F3 cellen en Ba/F3 cellen overexpressing Cas9 waren getransduceerde met pXPR-011 voor het meten van de Cas9 activiteit. Een vermindering van GFP correleert met verhoogde Cas9 activiteit. Ouderlijke Ba/F3 cellen zijn ~ 100% FITC + t.o.v. Ba/F3-Cas9 cellen waar de FITC met ~ 76% wordt verminderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: tijdlijn voor infectie en selectie van sgRNAs in Ba/F3 cellen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Binnenbrengen van + 1 bp frameshift mutaties de endogene Calr locus is voldoende om het verlenen van oncogene activiteit te Calr. (A-D) groeikrommes in ouderlijke Ba/F3-Cas9 cellen (A) Ba/F3-MPL-Cas9 cellen (B), Ba/F3-EPOR-Cas9 cellen (C), en Ba/F3-G-TSFR-Cas9 cellen (D) demonstreert IL-3 onafhankelijke groei in Calr-gerichte Ba / F3-MPL-Cas9 cellen alleen19. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Sanger sequencing verificatie. Bevestiging aan-doelgroep bewerken van endogene Calr (exon 9) in Ba/F3-MPL cellen. + 1 bp frameshift mutaties in zwart19worden aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Doel-gen sgRNA ID Doel de volgorde (5' naar 3') Strand Splijten-efficiëntie Af-doelscore
Calr M1 AGAGGACAAGAAGCGTAAAGAGG + 0,7 70
Calr m2 GAGGCTTAAGGAAGAAGAAGAGG + 0.3 28

Tabel 1:20-mer protospacer sequenties met inbegrip van de PAM site (in vet) voor twee sgRNAs dat targeting exon 9 van Calr 19.

Primer ID Volgorde (5' naar 3')
M1-F CACCGAGAGGACAAGAAGCGTAAAG
M1-R AAACCTTTACGCTTCTTGTCCTCTC
m2-F CACCGAGGCTTAAGGAAGAAGAAG
m2-R AAACCTTCTTCTTCCTTAACCTC

Tabel 2: Protospacer sequenties en hun omgekeerde aanvulling met "CACC" en "AAAC" toegevoegd voor het klonen in lolploeg-gids vector met behulp van restrictie-enzym BsmBI 19.

Primer ID Volgorde (5' naar 3')
Calr_Fwd ACCACCTGTCTTTCCGTTCT
Calr_Rev GGCCTCTACAGCTCATCCTT

Tabel 3: CRISPR screening van PCR inleidingen bedrijven stroomopwaarts en stroomafwaarts van de breukzijde van de sgRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier tonen we het gebruik van CRISPR/Cas9 gene bewerken om te bestuderen van de biologische functie van CALR mutaties in hematopoietische cellen. Het succes van dit protocol is sterk afhankelijk van meerdere factoren. Ten eerste is het belangrijk om te weten wat voor soort mutaties mogelijk verantwoordelijk voor het fenotype dat gewenst is. In dit protocol, de uitlezing is de transformatie van Ba/F3 cellen mIL-3 onafhankelijkheid en de soorten mutaties zijn microdeleties in exon 9 van CALR. Echter, als de gewenste mutatie een enkelvoudige basenpaar substitutie is, dan HDR-gemedieerde reparatie is de geprefereerde methode omdat het precieze puntmutaties of ingevoegde van een single-strand of double-stranded DNA donor sjabloon2, voeren kan 3. als het gewenst is om knock-out het gen, dan is de oprichting van grootschalige genomic verwijderingen gericht op vroege codering exons voorkeur20.

Ten tweede, moet de cellijn cytokine-afhankelijke zodat de positieve selectie druk post cytokine terugtrekking. Het is belangrijk op te merken dat niet alle cellijnen stabiele uitdrukking van Cas9 tolereren kunnen (zie stap 6.3). Dit kan te wijten zijn aan de selectie van de blasticidin, die wordt niet getolereerd door alle cellijnen. In dit geval kan de keuze van andere Cas9 constructies met verschillende selectie cassettes nodig zijn. Een waarschuwing van het gebruik van cytokine-afhankelijke cellijnen, zoals Ba/F3 cellen is dat ze vatbaar zijn voor onafhankelijke groei in spontane cytokine, soms als gevolg van de overname van mutaties in het ectopically geformuleerde gen van belang na cytokine intrekking21. Bijgevolg is het gebruik van passende controles nodig om er zeker van te zijn dat de waargenomen cellulaire transformatie te wijten aan aan-target CRISPR gene bewerken is. In dit protocol, hebben we niet waarnemen cellulaire transformatie in Ba/F3-MPL cellen getransduceerde met een niet-gerichte controle van de sgRNA of in Ba/F3-EPOR en Ba/F3-GCSFR cellen getransduceerde met Calr-gerichte sgRNAs. Dit biedt meer vertrouwen dat cellulaire transformatie in Ba/F3-MPL cellen een resultaat is van aan-doelgroep bewerken van de endogene Calr locus.

In dit protocol introduceert DNA-herstel door NHEJ microdeleties van variabele grootte zoals te zien in Figuur 5. De analyse door Sanger sequencing werd uitgevoerd op een sub steekproef van de populatie van de bulk van bewerkte cellen om te kijken voor de uitbreiding van microdeleties die tot + 1 bp frameshift mutaties post cytokine intrekken leiden. Volgende generatie rangschikken vermeld in stap 9,9 een meer robuuste manier is te kwantificeren op doelsoort bewerken voor bulk-cel populaties. Als analyse van een specifieke kloon is gewenst, vervolgens is één cel sorteren van de bulk bevolking noodzakelijk. Eencellige sorteren is gunstig in het begrip van het biologische effect als gevolg van een bepaald soort mutatie en is handig als het doel is te begrijpen van de verschillen tussen twee verschillende soorten mutaties.

Een zorg met de CRISPR/Cas9-systeem is uit-target effecten, die decollete gebeurtenissen buiten het gerichte gebied zijn. Om te beoordelen van het specifieke karakter van de CRISPR/Cas9-systeem en om ervoor te zorgen dat de getransformeerde bevolking geen eventuele af-target effecten leidt tot de waargenomen transformatie bevatten, zouden we moeten onderzoeken of een genoom bewerking is uitgevoerd buiten het gebied van belang. Dit kan gebeuren door op zoek naar bewijs van Cas9/NHEJ-driven genoom bewerken op potentiële af-target genomic loci met aanzienlijke reeks gelijkenis met het beoogde doel. Hiervoor volgende generatie sequencing kan ook worden gebruikt om de frequentie van off-target effecten op bepaalde locaties langs het genoom kwantitatief te evalueren. Verklein de kans op uit-target effecten en kunnen verschillende factoren worden opgenomen in het protocol. Zoals vermeld in de resultaten, het bestuderen van meerdere sgRNAs gericht op de regio van belang zorgt ervoor dat het fenotype een gevolg van een gebeurtenis op doelsoort zijn is. Recente studies hebben bovendien voorgesteld dat afgeknotte sgRNAs met 17 nucleotiden de frequentie van de af-target decollete gebeurtenissen22 verminderen kunnen. Bovendien, kan langdurige blootstelling aan Cas9 van stabiele expressie resulteren in een hogere frequentie van off-target effecten. Het is belangrijk op te merken dat een systeem van de dubbele vector met zowel Cas9 als de sgRNA kan worden gebruikt in het protocol in plaats van stabiele uitdrukking van Cas9; echter, deze vectoren neiging tot zeer groot worden en resulteren in een lage lentivirale titer en lagere efficiëntie van de infectie. Dientengevolge, kan voorbijgaande transfectie van de constructie van de Cas9 in de cellen door nucleofection worden gebruikt. Recente rapporten hebben ook Cas9 constructies ontwikkeld met hogere specificiteit aan doelsoort bewerken, zoals de eSpCas9 bouwen6.

Kortom vertegenwoordigt CRISPR/Cas9 een efficiënt, goedkoop en betrouwbaar genoom engineering tool, rekening houdend met de studie van genetische mutaties op fysiologische expressie niveaus. Hier gebruiken we CRISPR/Cas9 gene bewerken als een robuuste en efficiënte methode om inzicht te krijgen in de functionele gevolgen van CALR mutaties in hematopoietische cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen conflicten van belang aan dit verslag gerelateerde.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de NIH (R01HL131835), een Damon Runyon klinisch onderzoeker award en de Starr kanker Consortium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BsmBI New England Biolabs R0580L
Blasticidin Sigma Aldrich 15025
Puromycin Life Technologies A1113803
Stbl3 cells Life Technologies C737303
TransIT-LT1 Thermo Fisher Scientific MIR2300
Opti-MEM Life Technologies 51985034
RPMI Thermo Fisher Scientific MT10040CV
DMEM Thermo Fisher Scientific 10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS) Omega Scientific FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine Life Technologies 10378016
mIL-3 Peprotech 213-13
psPAX2 Addgene N/A
pCMV-VSV-G Addgene N/A
pLX_TRC311-Cas9 Addgene N/A
polybrene Sigma Aldrich H9268
pXPR-011 Addgene N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS) Genessee Scientific 25-507
TAE buffer Thermo Fisher Scientific FERB49
LentiGuide-Puro Addgene Plasmid #52963
PNK New England Biolabs M0201S
T4 ligase New England Biolabs M0202S
PCR purification kit Qiagen 28104
Miniprep kit Qiagen 27104

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
  2. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
  3. Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
  4. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  5. Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
  6. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
  7. Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
  8. Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
  9. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  10. Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
  11. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
  12. Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
  13. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  14. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
  15. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
  16. Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
  17. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
  18. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
  19. Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
  20. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
  21. Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
  22. Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).

Tags

Kankeronderzoek kwestie 131 CRISPR Cas9 gene bewerken sgRNA calreticulin sequencing verslaggever
Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abdelfattah, N. S., Mullally, A.… More

Abdelfattah, N. S., Mullally, A. Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells. J. Vis. Exp. (131), e56726, doi:10.3791/56726 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter