CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집
Summary
타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.
Abstract
클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)는 CRISPR 관련 (Cas) 9 사이트별 진 핵 게놈에 대 한 같은 RNA 기반 nucleases 생성을 과학자 들에 의해 다른 용도로 원핵생물에서 적응 면역 시스템 편집. Cas9에 의해 게놈 엔지니어링 효율적으로 쉽고 튼튼하게 많은 biomedically 관련 된 포유류 세포와 유기 체에 내 생 유전자를 수정 하는 데 사용 됩니다. 여기 우리가 특정 유전자 변이의 생물 학적 기능을 이해 하는 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 하는 방법의 예를 보여줍니다. 우리는 특정 지역에서 생 Calr 소재 시를 대상으로 한 가이드 RNAs (sgRNAs)의 전달에 의해 murine 인터 루 킨-3 (밀-3) 종속 프로 B (Ba/F3) 셀에 calreticulin (CALR) 돌연변이 모델 어디 삽입 또는 삭제 (indel ) CALR 돌연변이 myeloproliferative 신생 (MPN), 혈액 암의 일종을 가진 환자에서 발생. sgRNAs 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 다양 한 크기의 indels를 주고 수리는 대상된 지역에 두 배 물가 틈 (DSBs)을 만듭니다. 우리 다음 조 혈 모 세포 변환에 Calr 돌연변이의 생리 적 수준 식이의 영향을 이해 하 표준 바/F3 세포 변환 분석 결과 사용 합니다. 이 방법은 다양 한 포유류 세포 라인에 그들의 생물학 기능을 공부 하기 다른 유전자에 적용할 수 있습니다.
Introduction
CRISPR/Cas9 기술 최근 살아있는 세포와 유기 체에서 편집 하는 타겟된 게놈 혁명 있다. 그것은 생물 의학 연구를 위한 매우 강력한 도구가 되고있다 고 현재1유전자 질환 치료에 대 한 잠재적인 애비뉴로 널리 사용 되 고 있다. 모든 게놈 편집 도구에 대 한 기초 수정할 genomic 소재 시에 nuclease 유도 DNA 두 배 좌초 휴식 (DSB)의 생성에 의존 합니다. DSBs 비 동종 끝-결합 (NHEJ) 또는 상 동 감독 수리 (HDR)2,3에 의해 수리 수 있습니다. Cas9 nuclease 엔지니어링 nucleases 아연 손가락 nucleases (ZFNs) 같은 다른 게놈에 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs)의 장점은 RNA에 대 한 그것의 의존 대상 비교 원하는 DNA 시퀀스를 nuclease에 대 한 에 ZFNs 및 TALENs2,3에 단백질 DNA 상호 작용.
Prokaryotic 세포4,5에 적응 면역 시스템으로 CRISPR/Cas9 nuclease 통로의 발견 후 많은 노력 적응 포유류 세포 선 및 모델 생물2, 에 사용 하기 위해 통로에 간 3. 유전자 편집 도구로, CRISPR/Cas9 통로 활용 두 가지 주요 구성 요소: 연쇄 상 구 균 pyogenes (Sp) 파생 Cas9 nuclease 관심2,3의 유전자를 대상으로 하는 sgRNAs. sgRNA 20 뉴클레오티드 RNA DNA 기본적인 쌍 complementarity2,3게놈에 특정 사이트에 직접 그 Cas9로 구성 됩니다. 대상 사이트는 sgRNA의 옆의 5′ NGG SpCas9 nuclease에 의해 인식 되는 형태로 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 사이트에 있어야 합니다. 이러한 도구를 사용 Cas9 sgRNAs 대상 관심 영역을 설계 하 여 어떤 DNA 순서를 이동 수 있습니다. 또한 Sp Cas9 파생, 특정 응용 프로그램에 따라 다른 특징을 가진 Cas9에 대 한 추가 변종이 있습니다. 예를 들어 편집 하는 대상에 대 한 높은 특이성 또는6,7nicking dna 단일 가닥 절단 용량 Cas9 변종이 있습니다. 또한, 촉매로 비활성 Cas9 최근 transcriptional 규칙8에 대 한 개발 되었습니다. 과학자 들은 이제 다양 한 유전자 쫓 고 녹아웃 유전자9, 기능 손실 및 이득의 함수 라이브러리 화면10 및 유전 생물 학적 기능 연구 등의 응용 프로그램에 대 한 CRISPR/Cas9 시스템 사용 모델 생물11의 공학입니다.
이 프로토콜에서 우리 CALR 돌연변이의 생물 학적 기능을 이해 하 바/F3 세포 변환 분석 결과와 CRISPR/Cas9 방법론을 결합 한다. 학사/f 3 셀은 murine IL 3 종속 조 혈 세포 라인 IL 3 렌더링 될 수 있는 특정 oncogenes BCR ABL12등의 표현에 따라 독립. 이해 여부 돌연변이 calreticulin cytokine 독립적인 성장에 바/F3 셀을 변형할 수 있다, 우리는 엑손 9 indel 돌연변이 소개 하는 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 내 인 성 Calr 소재 시의 대상으로 하 고 다음 적용할 셀에서 IL-3를 철회를 긍정적인 선택 압력, 업과 MPN 환자에서 발견 기능 이득 CALR 돌연변이의 목표와 함께. 프로토콜 포함 디자인, 복제 및 sgRNAs, 안정적인 Cas9 표현 세포의 개발의 전달 하 고 CRISPR에 대 한 심사 대상 유전자 편집. 이 프로토콜 다른 유전자와 관심의 다양 한 cytokine 종속 셀 라인에 적용할 수 있는 모델링 및 암에서 관련된 유전자의 생물 학적 기능 공부에서 특히 중요 하며
Protocol
Representative Results
Discussion
여기 우리 공부 조 혈 모 세포에서 CALR 돌연변이의 생물학 기능을 편집 하는 CRISPR/Cas9 유전자의 사용을 보여 줍니다. 이 프로토콜의 성공은 매우 여러 요인에 따라 달라 집니다. 첫째, 그것은 어떤 종류의 돌연변이 원하는 표현 형에 대 한 책임 수 있습니다 아는 것이 중요입니다. 이 프로토콜에서 판독 밀 3 독립 학사/f 3 셀의 변화 이며 돌연변이의 유형은 indels CALR의 엑손 9에. 그러나, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (R01HL131835), Damon Runyon 임상 조사 상 및 스타 암 협회에 의해 지원 되었다.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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