كريسبر/Cas9 باستخدام الجينات للتحقيق في نشاط النمطان Calreticulin المسخ في الخلايا المكونة للدم سيتوكين تعتمد على تحرير
Summary
تحرير الجينات المستهدفة باستخدام كريسبر/Cas9 وسهلت إلى حد كبير فهم الوظائف البيولوجية للجينات. هنا، فنحن نستخدم المنهجية كريسبر/Cas9 إلى نموذج calreticulin الطفرات في الخلايا المكونة للدم تعتمد على سيتوكين بغية دراسة نشاطها النمطان.
Abstract
مجمع إينتيرسباسيد بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) هو نظام مناعة تكيفية في بدائيات النوى التي قد تم إعادة توجيه الغرض منه بالعلماء لتوليد nucleases الموجهة بالجيش الملكي النيبالي، مثل المرتبطة كريسبر (Cas) 9 للجينوم التوكسينات الخاصة بالموقع تحرير. ويستخدم هندسة الجينوم ب Cas9 بكفاءة وسهولة وقوة تعديل الجينات الذاتية في العديد من خطوط الخلايا الثديية الوسائل ذات الصلة والكائنات الحية. هنا نعرض مثالاً لكيفية الاستفادة من المنهجية كريسبر/Cas9 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات الوراثية المحددة. نحن نموذج كالريتيكولين (كالر) الطفرات في مورين انترلوكين-3 (mIL-3) برو-ب (بكالوريوس/F3) الخلايا التابعة بتقديم دليل واحد الكشف (سجرناس) تستهدف محور كالر الذاتية في منطقة محددة حيث الإدراج أو الحذف (إينديل ) تحدث الطفرات كالر في المرضى الذين يعانون من الأورام ميلوبروليفيراتيفي (MPN)، هو نوع من سرطان الدم. سجرناس إنشاء فواصل حبلا مزدوجة (دسبس) في المنطقة المستهدفة التي يتم إصلاحها قبل نهاية غير المتجانسة الالتحاق بالعمل (نج) لإعطاء إينديلس من مختلف الأحجام. ثم نتبعها مقايسة التحول الخلوي با/F3 القياسية فهم تأثير التعبير مستوى الفسيولوجية للطفرات كالر على تحول الخلايا المكونة للدم. ويمكن تطبيق هذا النهج على جينات أخرى لدراسة وظيفتها البيولوجية في مختلف خطوط خلايا الثدييات.
Introduction
وثورة التكنولوجيا كريسبر/Cas9 مؤخرا تحرير الجينوم المستهدفة في الخلايا الحية والكائنات الحية. فقد أصبحت أداة قوية للغاية للبحوث الطبية الحيوية، ويستخدم حاليا كأحد السبل الممكنة للعلاج من الأمراض الوراثية1. أساسا لجميع أدوات التحرير الجينوم تعتمد على إنشاء المستحثة نوكلاس الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل فاصل (جهاز تسوية المنازعات) في موضع الجينوم إلى تعديل. يمكن إصلاحه في دسبس غير المتجانسة نهاية-الالتحاق بالعمل (نج) أو إصلاح موجه التماثل (HDR)2،3. وميزة نوكلاس Cas9 على الجينوم أخرى الهندسة نوكليسيس، مثل نوكليسيس إصبع الزنك (زفنس) والنسخ المستجيب المنشط–مثل نوكليسيس (تالينس) هو اعتمادها على الحمض النووي الريبي لاستهداف نوكلاس لتسلسل الحمض النووي المطلوب، مقارنة لتفاعلات البروتين-الحمض النووي وجدت في2،زفنس وتالينس3.
بعد اكتشاف المسار نوكلاس كريسبر/Cas9 كنظام المناعة تكيفية في خلايا بدائية4،5، وقد بذلت جهود كبيرة في تكييف مسار لاستخدامها في خطوط خلايا الثدييات ونموذج الكائنات الحية2، 3-يستخدم مسار كريسبر/Cas9 كأداة لتحرير الجينات، عنصرين رئيسيين هما: العقدية المقيّحة (Sp) تستمد نوكلاس Cas9 واستهداف الجين للفائدة2،3سجرناس. سجرنا يتكون من 20 النيوكليوتيدات أن Cas9 مباشرة إلى موقع معين على الجينوم عن طريق الحمض النووي الريبي زوج قاعدة التكامل2،3. يجب أن تقع موقع الهدف سجرنا المتاخمة لموقع بروتوسباسير عزر المتاخمة (بام) في شكل 5 ‘ نج، الذي يعترف به نوكلاس SpCas9. مع هذه الأدوات، يمكن توجيه Cas9 إلى أي تسلسل الحمض النووي بتصميم سجرناس التي تستهدف منطقة الفائدة. وبالإضافة إلى ذلك هناك Sp تستمد Cas9، المتغيرات الإضافية ل Cas9 مع ميزات مختلفة تبعاً لتطبيق معين. على سبيل المثال، هناك متغيرات Cas9 مع خصوصية أعلى للتحرير على الهدف أو قدرة الانقسام حبلا واحد للحمض النووي نيكينج6،7. وعلاوة على ذلك، وضعت مؤخرا لتنظيم النسخي8Cas9 حفازة نشطة. استخدم العلماء الآن النظام كريسبر/Cas9 لمجموعة متنوعة من التطبيقات، مثل knockin الجينات وخروج المغلوب لدراسة الوظائف البيولوجية للجينات9وفقدان لوظيفة ومكسب للدالة مكتبة شاشات10 والوراثية هندسة نموذج الكائنات11.
في هذا البروتوكول، قمنا بضم المنهجية كريسبر/Cas9 مع المقايسة الخلوية التحول با/F3 لفهم الوظيفة البيولوجية للطفرات كالر . با/F3 الخلايا هي مورين خط خلية المكونة للدم تابعة إيل-3 الذي يمكن أن يصبح إيل-3 مستقلة عند التعبير عن بعض المسرطنة مثل المركز قبل12. من أجل فهم سواء calreticulin المسخ يمكن تحويل الخلايا با/F3 للنمو المستقل سيتوكين، استهدفت إكسون 9 من محور كالر الذاتية باستخدام كريسبر/Cas9 إلى استحداث الطفرات إينديل وثم انسحب إيل-3 من الخلايا لتطبيق اختيار إيجابي الضغط، مع هدف أتصدى الطفرات كالر مكسب للدالة الموجودة في المرضى MPN. البروتوكول يشمل التصميم، والاستنساخ وتسليم سجرناس، تنمية مستقرة Cas9 الخلايا وإذ تعرب عن والكشف عن كريسبر على المستهدفة تحرير الجينات. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على جينات مختلفة ومختلف خطوط الخلية سيتوكين-تعتمد على الفائدة وهي ذات قيمة خاصة في وضع النماذج ودراسة الوظيفة البيولوجية من الجينات المعنية بسرطان.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نظهر استخدام تحرير الجينات كريسبر/Cas9 لدراسة الوظيفة البيولوجية كالر الطفرات في الخلايا المكونة للدم. أن نجاح هذا البروتوكول يعتمد اعتماداً كبيرا على عوامل متعددة. أولاً، من المهم أن نعرف ما هي أنواع الطفرات قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري الذي هو المطلوب. في هذا البروتوكول، قراء?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يدعمها هذا العمل في المعاهد الوطنية للصحة (R01HL131835)، وعلى جائزة رونيون ديمون محقق السريري واتحاد السرطان ستار.
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
