CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集
Summary
CRISPR/Cas9 を使用して、編集対象となる遺伝子は、遺伝子の生物機能の理解を促進しています。ここでは、その発癌性の活動を研究するためにサイトカイン依存性造血細胞のモデル カルレティキュリン変異に CRISPR/Cas9 方法論を活用します。
Abstract
クラスター化された空間定期的に短い回文繰り返し (CRISPR) は CRISPR 関連 (Cas) 9 サイト固有の真核生物ゲノムのなどの RNA 誘導の核酸を生成する科学者によって用途が変更されている原核生物の適応免疫システム編集します。Cas9 によるゲノム工学を使用して、効率的に、簡単に、確実が多く biomedically に関連する哺乳類細胞および生物における内在性の遺伝子を変更します。ここで特定の遺伝の突然変異の生物学的機能を理解する CRISPR/Cas9 方法論を利用する方法の例を紹介します。シングル ガイド Rna (sgRNAs) 特定の地域における内因性Calr座をターゲットの配信によってカルレティキュリン (CALR) 変異によるインターロイキン 3 (mIL-3) 依存プロ B (Ba/F3) 細胞内モデル、挿入・削除 (塩基) 骨髄増殖性腫瘍 (MPN)、血液の癌の種類と患者のCALRの突然変異が発生します。SgRNAs は、非相同末端結合 (NHEJ) 様々 なサイズの indels の扱いを与えることで修復されている対象地域の二重鎖切断 (Dsb) を作成します。我々 は、造血細胞変換のCalr突然変異の生理的レベル式の効果を理解する、標準 ba/f3 細胞形質転換試験を採用しています。このアプローチは、様々 な哺乳類細胞の生物学的機能を研究する他の遺伝子に適用できます。
Introduction
CRISPR/Cas9 技術最近生きている細胞および生物における標的ゲノム編集をもたらしました。それは生物医学研究のための非常に強力なツールとなっている、現在遺伝病1の治療のための潜在的な道として利用されています。すべてのゲノムの編集ツールのための基礎は変更する genomic 位置で、ヌクレアーゼによる DNA 二重鎖切断 (DSB) の作成に依存します。非相同末端結合 (NHEJ) または相同監督修理 (HDR)2,3によって、Dsb を修復できます。他のゲノムの核酸、亜鉛指核酸 (ZFNs) などを工学上 Cas9 ヌクレアーゼと転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) の利点は、比較目的の DNA シーケンスにヌクレアーゼのターゲット RNA 依存性ZFNs と TALENs2,3の蛋白質 DNA 相互作用。
原核細胞4,5適応免疫系として CRISPR/Cas9 ヌクレアーゼ経路の発見は後、多くの努力は哺乳類セルライン、モデル生物2,用経路の適応になっています。3。 遺伝子編集用ツールとして CRISPR/Cas9 経路は 2 つの主要なコンポーネントを利用して: Cas9 ヌクレアーゼと sgRNAs 金利2,3の遺伝子をターゲットに化膿連鎖球菌(Sp) が派生しました。SgRNA は、20 ヌクレオチド RNA DNA 塩基の相補性2,3ゲノムの特定のサイトに、直接 Cas9 で構成されます。SgRNA のターゲット サイトは 5′ SpCas9 ヌクレアーゼによって認識され、NGG の形で protospacer の隣接するモチーフ (PAM) のサイトに隣接してある必要があります。これらのツールは、sgRNAs を対象とする関心領域を設計することによって任意の DNA シーケンスに Cas9 を送信できます。さらに Sp Cas9 を得、特定のアプリケーションによって異なる機能を持つ Cas9 の追加バリエーションがあります。たとえば、対象の編集に高い特異性と6、7の刻み目をつける人 DNA の単鎖切断能力 Cas9 バリエーションがあります。さらに、触媒非アクティブ Cas9 は最近転写調節8に開発され。科学者は、遺伝子のノックやノックアウト遺伝子9、機能喪失、利得関数のライブラリ画面10と遺伝子の生物学的機能を研究するなど、アプリケーションのさまざまな CRISPR/Cas9 システムを使用している今モデル生物11工学。
このプロトコルではCALRの突然変異の生物学的機能を理解する、ba/f3 細胞形質転換試験 CRISPR/Cas9 の方法論と組み合わせています。Ba/f3 細胞は IL 3 に表示できるマウス IL 3 依存造血細胞ライン BCR-ABL12など特定の遺伝子の発現に依存します。変異カルレティキュリン ba/f3 細胞サイトカイン依存性の成長を変換できるかどうかを理解するためには、CRISPR/Cas9 を使用して塩基変異を導入する内因性のCalr座のエクソン 9 を対象とし、適用するセルから IL 3 を撤回した、正の選択圧、MPN 患者は、利得関数のCALR突然変異をさたことを目標にします。デザイン、クローニング、sgRNAs、Cas9 の安定発現細胞の開発の配信プロトコルが含まれ、CRISPR 検診対象の遺伝子編集します。このプロトコルは異なる遺伝子または様々 なサイトカイン依存性細胞線に適用できるし、モデリングと癌関連遺伝子の生物学的機能を勉強で特に有用。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで我々 は造血細胞のCALR突然変異の生物学的機能を研究する CRISPR/Cas9 遺伝子編集の使用を示します。このプロトコルの成功は複数の要因に依存します。まず、どのような種類の突然変異は、望まれる表現型の責任を知ることが重要です。このプロトコルでは読み出しはミル 3 独立 ba/f3 細胞のトランスフォーメーションと突然変異の種類です。 CALRのエクソン 9 オクターリピ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH (R01HL131835)、デイモン ・ ラニアン臨床賞、スターがんコンソーシアムによって支えられました。
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
References
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