Oogenesis i pattedyr er kjent for å være utsatt for feil, spesielt på grunn av kromosom missegregation. Denne oppgaven beskriver chromatin spre forberedelse metoder for mus prophase, metaphase jeg og II-trinnvis oocytes. Disse grunnleggende teknikkene tillater for studier av chromatin-bundet proteiner og kromosom morfologi gjennom pattedyr oogenesis.
Chromatin spredning teknikker har vært mye brukt til å vurdere den dynamiske lokaliseringen av under gametogenesis, spesielt for spermatogenesis. Disse teknikkene tillater for visualisering av protein og DNA lokalisering mønstre under meiotic hendelser som homologe kromosomer sammenkobling, Adept og DNA reparasjon. Mens noen protokoller har blitt beskrevet i litteraturen, er generelle chromatin spredning teknikker bruker pattedyr prophase oocytes begrenset og vanskelig på grunn av tidspunktet av meiose i fosterets eggstokkene. Til sammenligning kan prophase spermatocytes hentes fra unge mannlige mus med høyere avkastning uten behov for microdissection. Det er imidlertid vanskelig å få en ren synkronisert populasjon av celler på bestemte stadier på grunn av heterogenitet av meiotic og etter meiotic bakterie celle populasjoner i juvenile og voksen testikkel. Senere stadier av meiose er det en fordel å vurdere oocytes gjennomgår meiose jeg (MI) eller meiose II (MII), grupper av eldre oocytes kan være samlet inn fra voksne kvinnelige mus og stimuleres til å gjenoppta meiose i kultur. Her metoder for meiotic chromatin spre preparater med oocytes dissekert fra fosterets, neonatal og voksen eggstokkene er beskrevet med tilhørende video demonstrasjoner. Kromosom missegregation hendelser i pattedyr oocytes er hyppig, spesielt under MI. Disse teknikkene kan brukes til å vurdere og beskrive effekten av ulike mutasjoner eller miljømessige eksponeringer i ulike stadier av oogenesis. Som det er tydelige forskjeller mellom oogenesis og spermatogenesis, er teknikkene innen uvurderlig å øke vår forståelse av pattedyr oogenesis og dekket av hvit funksjonene i kromosom og protein dynamics under meiose .
Under spermatogenesis, er store halvsynkron bølger av meiotic bakterie celler raskt og fortløpende fornyes i testikkel ved utbruddet av puberteten og hele voksenlivet1. I motsetning til menn startes meiose i kvinner utelukkende under fosterets utvikling. Etter fødselen, oocytes fortsatt arrestert i en langvarig dictyate fase av prophase med en intakt germinal vesicle (GV, kjernefysiske konvolutten) før puberteten. Ved utbruddet av puberteten, et delsett av oocytes er syklisk valgt å gjennomgå vekst og modning, merking initiering av meiotic gjenopptakelse. Meiotic gjenopptakelse i fully-grown oocytes er manifestert av forsvinningen av GV i en prosess kalt germinal vesicle nedbryting (GVBD). Oocyte gjennomgår deretter kromosom kondens og segregering, etterfulgt av polar kroppen ekstrudering. Oocytes bli arrestert på progresjon til MII og stimuleres til å fullføre den andre og siste meiotic divisjonen bare etter befruktning.
Kvinnelig fertilitet er svært avhengig av suksessen til meiotic prophase jeg progresjon. Nøkkelen til dette er dannelsen av en fysisk kobling mellom homologe kromosomer kjent som chiasmata, som er formidlet av reparasjon av indusert DNA dobbel-strand bryter (DSBs) via crossover rekombinasjon2. Dette skjer innenfor rammen av en dynamisk proteinrik stillaset kalles synaptonemal komplekset (SC) som danner mellom homologe kromosomer å lette deres Adept3. SC er en glidelås som tre struktur som består av to parallelle lateral elementer forbundet med sentrale regionen proteiner som holder homologs sammen gjennom pågående DNA-reparasjon. Før Adept danne forløpere for sideveis elementer, kalt aksial elementer, mellom søster chromatids. Synaptonemal kompleks proteiner som SYCP2 og SYCP3 danner aksial elementer som colocalize til søster-chromatid samhold aksene under tidlig prophase. Disse senere være bindende områder for tverrgående filament protein, SYCP1, som sentralt element montering og Adept mellom justert homologs4. I mus oocytes angis komplett Adept av tilstedeværelsen av 20 helt overlappende SYCP3 og SYCP1 strekninger, som kan visualiseres med chromatin spredt forberedelser. Adept er fullført ved inngåelse av pachytene substage, der modne overganger som skal sendes til skjemaet chiasmata mellom homologs er dekorert med mutL homolog (MLH1/3) dimers å fremme deres nøyaktige behandling5,6 , 7. strukturelle vedlikehold av kromosomer (SMC) komplekser, inkludert cohesin, condensin og SMC5/6 komplekse, er viktig for regulering av kromosom dynamikk og struktur gjennom meiose8,9, 10,11,12. Samlet sikre disse hendelsene riktig bi-retning av homologe kromosomer til motstridende spindel polakkene etter demontering av SC.
Meiotic celle syklusen er en effektiv modell undersøke rollene som ulike proteiner i genomet vedlikehold programmert induksjon og etterfølgende reparasjon av DNA DSBs. Videre er pattedyr meiose også en aktuelle modell for studiet av epigenetic endringer og preging13. Men er det teknisk vanskelig å vurdere disse hendelsene under kvinnelige meiose, som finner sted i fosterlivet og neonatal eggstokkene hos pattedyr (figur 1). Prophase jeg kan deles inn i 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema og dictyate. Her beskriver vi hvordan å isolere og skille mellom fosterets og neonatal eggstokker og testikler (figur 2). Tilpasset fra tidligere beskrevet metoder, dette manuskriptet også skisserer en protokoll (trinn 1) med video demonstrasjon for utarbeidelse av kvinnelige meiotic prophase jeg chromatin sprer14,15,16,17 . Når kombinert med immunolabelling, som beskrevet i trinn 6-7, denne protokollen gir detaljert mikroskopisk analyse av prophase jeg hendelser i oocytes.
Oogenesis er utsatt for feil, og kromosom missegregation hendelser i den første meiotic divisjonen representerer den vanligste kilden til genetisk sykdom i avkom18,19. I dette manuskriptet (protokollen trinn 2) beskriver vi en protokoll som modne GV-trinnvis oocytes trekkes ut fra primet eggstokkene voksne kvinnelige mus. Under støttende forhold gjennomgå fully-grown oocytes luteiniserende hormon-uavhengig gjenopptakelse av meiose etter isolasjon og kultur20. Etter meiotic gjenopptakelse, oocytes fremdrift gjennom meiose jeg og arrestere på metaphase II. Oocytes forblir arrestert på metaphase II, med mindre befruktet. I trinn 2 – 5: vi tilpasse tidligere rapportert protokoller med video demonstrasjon å beskrive hvordan å samle, kultur og forberede MI og MII oocytes chromatin spre forberedelser21. Denne chromatin spre teknikken gir klare immunolabelling proteiner tilknyttet kromosomer. Videre denne protokollen kan også brukes til å skille mellom bivalent og funksjonelle grupper som består kromosomer, og kan videre løse enkelt søster chromatids å lette vurdering av oocyte ploidy. Derfor, i tillegg til avsløre lokalisering mønstre av meiotic proteiner, denne protokollen kan også tjene som et uvurderlig verktøy for Klargjørende mulige årsaker til kromosom missegregation MI og MII.
Chromatin spredning forberedelser tillate forskere å studere kronologisk kvinnelige pattedyr meiose og den dynamiske lokaliseringen av proteiner involvert. Embryonale og neonatal chromatin oppslag gir omfattende analyse av arrangementer gjennom meiotic prophase. Metaphase jeg og metaphase II chromatin oppslag kan brukes til å skille enkelt søster chromatids fra sammenkoblet søstre og sammenkoblede homologe kromosomer, samt vurdere ploidy. Sammenligning kan protokollen beskrevet her være fordelaktig forhold til hele …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIGMS (R01GM11755) til P.W.J og en trening grant fellowship fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) G.H. og J.H.
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |