Oogenesis memelilerde özellikle kromozom missegregation nedeniyle hataya, olduğu bilinmektedir. Bu el yazması için fare profaz, yaymak Kromatin hazırlama yöntemleri açıklar metafaz ı ve II sahnelenen yumurtalar. Bu temel teknikler Kromatin bağlı proteinler ve kromozom morfolojisi memeli oogenesis boyunca çalışma sağlar.
Kromatin yayılmış teknikleri yaygın olarak gametogenesis, sperma için özellikle sırasında çeşitli proteinlerin yerelleştirme dinamik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu teknikler izin homolog kromozom çifti, gibi segregasyonun olaylar sırasında protein ve DNA yerelleştirme desen canlandırma için synapsis ve DNA tamir. Birkaç protokolleri literatürde tarif var, genel Kromatin yayılmış teknikleri memeli profaz yumurta kullanarak sınırlı ve fetal yumurtalık mayoz inisiyasyon zamanlama nedeniyle zor vardır. Buna karşılık, profaz spermatocytes mikrodiseksiyon gerek kalmadan daha yüksek verimleri ile genç erkek fareler gelen toplanabilir. Ancak, hücre saf bir eşitlenmiş nüfusu nedeniyle çocuk ve yetişkin testis segregasyonun ve sonrası segregasyonun germ hücre popülasyonlarının heterojen belirli aşamalarında elde etmek zordur. Mayoz sonraki aşamalarını için yumurta geçiren mayoz ben (MI) veya mayoz II (MII), çünkü yetişkin dişi fareler toplanan ve mayoz kültür devam etmek için teşvik olgun yumurta grupları değerlendirmek için avantajlıdır. Burada, yumurta kullanarak segregasyonun Kromatin yaymak hazırlıkları için yöntemler üzerinden fetal, Yenidoğan disseke ve yetişkin yumurtalık video gösteriler eşlik ile açıklanmıştır. Kromozom missegregation memeli yumurta olaylarda özellikle MI sırasında sıktır. Bu teknikler değerlendirmek ve etkileri farklı mutasyon veya çevre Etkilenmeler oogenesis çeşitli aşamalarında tanımlamak için kullanılabilir. Oogenesis ve sperma arasında belirgin farklılıklar olduğundan, içinde açıklanan teknikleri memeli oogenesis anlayışımızı ve kromozom ve protein dinamiği cinsel dimorfik özellikleri mayoz sırasında artırmak için çok değerli .
Sperma sırasında büyük yarı zaman uyumlu dalgalar segregasyonun germ hücrelerinin hızla ve sürekli olarak ergenlik ve yetişkinlik1boyunca başlangıçlı, testis içinde doldurulan vardır. Erkeklerin aksine, mayoz dişilerde fetal gelişim sırasında yalnızca başlatılır. Doğum yumurtalar profaz uzun süreli dictyate aşamasında tutuklanan kalır ben bir bozulmamış germinal vezikül (GV; nükleer zarf) ergenlik kadar ile. Ergenlik başlangıcında, yumurta kümesini cyclically seçilir büyüme ve olgunlaşma, segregasyonun yeniden başlamasını inisiyasyon işaretleme geçmesi. Köklerin yumurta içinde segregasyonun yeniden başlamasını GV germinal vezikül arıza (GVBD) bilinen bir işlemle ortadan kalkması ile kendini gösteriyor. Yumurta sonra kromozom yoğunlaşma ve segregasyon, kutup vücut ekstrüzyon tarafından takip uğrar. Yumurtalar MII ilerleme üzerine tutuklandı olmak ve döllenme sonra ikinci ve son segregasyonun bölümü tamamlamak için uyarılmış.
Kadın doğurganlık segregasyonun profaz başarısı üzerine son derece bağımlı ben ilerleme. Bu indüklenen DNA Çift Kişilik kırılmalara (DSBs) crossover rekombinasyon2bağlantısı tamiri tarafından aracılık ettiği chiasmata olarak bilinen homolog kromozomlar arasında fiziksel bir bağlantı oluşumunu anahtarıdır. Homolog kromozomlar arasında onların synapsis3kolaylaştırmak için formlar synaptonemal kompleksi (SC) olarak bilinen dinamik bir protein açısından zengin iskele bağlamında bu işlem gerçekleşir. SC homologs birlikte boyunca devam eden DNA tamiri tutan Merkez Bölge proteinler tarafından bağlı iki paralel yanal öğelerden oluşur bir fermuar gibi üçlü yapısıdır. Synapsis önce Aksiyel öğeler, adı yanal elemanlarının öncüleri arasında kardeş chromatids oluştururlar. Synaptonemal kompleks proteinlerin SYCP2 ve SYCP3 gibi kardeş Kromatit uyum eksenleri sırasında erken profaz colocalize eksenel öğeleri oluşturur. Daha sonra siteleri enine filaman protein, Merkezi öğesi derleme ve synapsis hizalanmış homologs4arasında kolaylaştırır SYCP1 için bağlayıcı olarak hizmet vermektedir. Fare yumurtalar tam synapsis 20 varlığı ile tamamen SYCP3 ve SYCP1 uzanıyor, Kromatin kullanarak görüntülenir üst üste hazırlıklar yaymak belirtilir. Synapsis sayede formu chiasmata homologs arasında mukadder olan olgun kesişim onların doğru işleme5,6 tanıtmak için mutL homolog (MLH1/3) dimer ile dekore edilmiş olup pachytene substage girdiği üzerine tamamlandı , 7. kromozom (SMC) kompleksleri, cohesin, condensin ve SMC5/6 karmaşık, dahil olmak üzere yapısal bakımından önemli kromozom dinamikleri ve yapısı mayoz8,9, boyunca düzenlenmesi için 10,11,12. Toplu olarak, bu olaylar uygun BI-yönünü homolog kromozomlar iğ Polonyalılar SC sökme takip karşıt sağlamak
Segregasyonun hücre döngüsü genom bakım programlanmış indüksiyon ve DNA DSBs sonraki onarım nedeniyle çeşitli proteinlerin rolleri incelemek için güçlü bir modeldir. Ayrıca, memeli mayoz Ayrıca, epigenetik değişiklikler ve basma13ilgili bir modelidir. Ancak, memeliler (şekil 1) fetal ve neonatal yumurtalıklarda yer alan kadın mayoz sırasında bu olayları değerlendirmek teknik olarak zordur. 5 substages ayrılabilir profaz: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema ve dictyate. Burada, biz ayırmak ve fetal ve neonatal yumurtalıklar ve testis (Şekil 2) arasındaki farkı anlatan. Önceden açıklanan yöntemleri uyarlanmış, bu el yazması da bir iletişim kuralı (Adım 1) kadın segregasyonun profaz hazırlanması için video gösterisi ile özetliyor ben Kromatin yayılır14,15,16,17 . 6-7, adımlarda açıklandığı gibi immunolabelling ile birleştiğinde bu protokolü profaz detaylı mikroskopik analiz sağlar ben yumurta olaylarda.
Oogenesis hata eğilimli olduğunu ve kromozom missegregation olaylar ilk segregasyonun bölünme sırasında döl18,19genetik hastalığın en yaygın kaynağı temsil eder. Bu makale (iletişim kuralı adım 2), biz olgun yumurta GV sahnelenen yetişkin dişi fareler astarlanmalıdır yumurtalıklar ayıkladığınız bir protokol tanımlamak. Destekleyici koşullar altında köklerin yumurta yalıtım ve kültür20takip mayoz Lüteinizan bağımsız yeniden başlamasını tabi. Segregasyonun yeniden başlamasını takiben yumurta mayoz ilerleme sonra metafaz II tutuklayın. Yumurta döllenmiş sürece. metafaz II, tutuklandı kalır Adımları 2-5, biz daha önce raporlanmış iletişim kuralları toplamak, kültür ve yaymak Kromatin hazırlıklar21için MI ve MII yumurta hazırlamak nasıl açıklamak için video gösterisi ile uyum. Teknik yayılan bu Kromatin kromozom ile ilişkili proteinlerin açık immunolabelling sağlar. Ayrıca, bu iletişim kuralını bivalent ve univalent kromozomlar arasında ayırt etmek için de kullanılabilir ve daha fazla tek kız kardeşi çözümlemek için yumurta Ploitlik değerlendirilmesi kolaylaştırmak için chromatids. Bu nedenle, yerelleştirme desenleri segregasyonun proteinlerin açığa yanı sıra, bu iletişim kuralını da kromozom missegregation MI ve MII sırasında olası nedenleri elucidating paha biçilmez bir araç olarak hizmet edebilir.
Kromatin yayılmış hazırlıklar araştırmacılar dişi memeli mayoz ve proteinlerin dahil dinamik yerelleştirme kronolojik olarak çalışmaya izin verir. Embriyonik ve neonatal Kromatin yayılır segregasyonun profaz boyunca olayların yakın analiz için izin verir. Metafaz ben ve metafaz II Kromatin yayılır tek kız kardeşi fark için kullanılan chromatids gelen kız ve eşlenmiş homolog kromozomlar, Ploitlik değerlendirmek yanı sıra eşleştirilmiş. Buna karşılık, burada açıklanan Protokolü sık s…
The authors have nothing to disclose.
Bu eser G.H. ve J.H. eğitim grant bursu üzerinden Ulusal Kanser Enstitüsü (NIH) (CA009110) ve NIGMS (R01GM11755) P.W.J için tarafından desteklenmiştir
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |