Todimensjonal Gel geleelektroforese kombinert med massespektrometri metoder for en analyse av menneskelige hypofysen adenom vev proteom
Summary
Her presenterer vi en todimensjonal gel geleelektroforese (2DE) kombinert med massespektrometri (MS) til å skille og identifisere menneskelige hypofysen adenom vev proteom, som presenterer en god og reproduserbar 2DE mønster. Mange proteiner er observert i hver 2DE spot når analysere komplekse kreft proteom med bruk av høy følsomhet MS.
Abstract
Menneskelige hypofysen adenom (PA) er en vanlig svulst som oppstår i menneskelige hypofysen i hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel aksen systemer, og kan klassifiseres som enten klinisk funksjonelle eller nonfunctional PA (FPA og NFPA). NFPA er vanskelig for tidlig stadium diagnose og terapi på grunn av knapt heve hormonene i blodet sammenlignet FPA. Vårt langsiktige mål er å bruke Proteomikk metoder for å oppdage pålitelig biomarkers for avklaring av PA molekylære mekanismer og anerkjennelse av effektiv diagnostiske, prognostiske markører og terapeutiske mål. Effektiv todimensjonal gel geleelektroforese (2DE) kombinert med massespektrometri (MS) metoder ble presentert her for å analysere menneskelig PA proteomes, inkludert forberedelse av prøver, 2D gel geleelektroforese, protein visualisering, bildeanalyser, i-gel Trypsin fordøyelsen, peptid masse fingeravtrykk (PMF) og tandem masse massespektrometri (MS-/ MS). 2-dimensjonal geleelektroforese matrise-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-Væskekromatografi (Langbane) MS-/ MS prosedyrer er vellykket brukt i en analyse av NFPA proteom. Med bruk av en høy følsomhet masse spectrometer, ble mange proteiner identifisert med metoden 2DE-LC–MS-/ MS i hver 2D gel i en analyse av komplekse PA vev å maksimere dekningen av menneskelig PA proteom.
Introduction
PA er en vanlig svulst som oppstår i menneskelige hypofysen i hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel aksen systemer som lek betydelig rollene inne det menneskelige endokrine systemet. PA inkluderer klinisk funksjonelle og nonfunctional PAs (FPA og NFPA)1,2. NFPA er vanskelig i tidlig stadium diagnose og terapi fordi bare litt forhøyede hormonnivåene (f.eksLH og FSH) i blodet sammenlignet FPA, som har betydelig økte nivåer av tilsvarende hormoner i blodet3,4 ,5. Klargjøring av molekylære mekanismer og oppdagelsen av effektiv biomarkers har viktig klinisk betydning i diagnose, behandling og prognosen for NFPA. Vårt langsiktige mål er å utvikle og bruke proteomic metoder for å studere NFPA for å pålitelig biomarkers å avklare sin molekylære mekanismer og gjenkjenne effektiv terapeutisk mål samt diagnostiske og prognostiske markører. 2-DE kombinert med MS metoder har vært mye brukt i våre langsiktige forskningsprogram om menneskelig PA proteom1,2,6,7, inkludert etablering av proteom referanse kart3,8, analyse av ulikt uttrykt protein profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, post-translasjonell endringer som fosforylering14 og tyrosin nitration16,17,18, proteomic varianten av invasiv forhold til Noninvasiv NFPAs19og proteomic heterogenitet NFPA subtyper13, som førte til oppdagelsen av flere viktige pathway nettverk (mitokondrie dysfunksjon, celle syklus feilregulering, oksidativt stress og MAPK signalisering systemet abnormitet) som er endret i NFPA13,19,20.
2DE skiller proteiner deres isoelectric punkt (pI) (isoelectric fokus, IEF) og molekylvekt (via natrium dodecyl sulfate polyakrylamid gel geleelektroforese, SDS side)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dette er en vanlig og klassisk separasjon teknikk innen Proteomikk, siden introduksjonen av begrepene proteom og Proteomikk i 199524. MS er avgjørende teknikken for å finne ut identiteten til 2DE-separerte proteiner, inkludert PMF og MS-/ MS strategier. Svært rask utvikling av MS instrumenter, spesielt i aspekter av gjenkjenning følsomhet og oppløsning, i kombinasjon med forbedring av LC-systemet, forbedrer identiteten til lav eller svært lav overflod proteiner i en proteom å maksimere den dekning av en proteom. Det også utfordrer våre tradisjonelle begreper at bare én eller to proteiner i en 2D gel i en analyse av komplekse menneskelig vev proteom og gir en mulighet til å identifisere flere proteiner i en 2D gel i en analyse av komplekse menneskelig vev proteom og maksimere dekningen av NFPA proteom.
Her beskriver vi detaljerte protokoller av 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC-MS-/ MS som har blitt brukt i analysen av menneskelig NFPA proteom. Protokollene inkluderer forberedelse av prøver, første dimensjon (isoelectric fokus, IEF), andre dimensjonen (SDS-side), visualisering av proteiner (sølv flekker og Coomassie blå flekker), image analyse av 2D gel, i-gel trypsin fordøyelsen, rensing av tryptic peptider, PMF, MS-/ MS og database stekende3,8,25,26. Dessuten, denne protokollen lett oversettes for analyse av andre menneskelig vev proteomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE, kombinert med MS metoder, inkludert 2DE-MS PMF og 2DE-MS/MS, har blitt brukt i vårt langsiktige program – bruk av Proteomikk menneskelige NFPA proteomic variasjoner og molekylære nettverk varianter for utviklingen av molekylære mekanismer og oppdagelsen av effektiv biomarkers for NFPAs. 2DE-baserte sammenlignende Proteomikk med god reproduserbarhet spiller en viktig rolle i identifikasjon av NFPA proteomic variasjoner9,10,11</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation av Kina (Grant nr. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskudd fra Kina “863” planlegger Project (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ) og Xiangya Hospital midlene Talent introduksjon (til XZ) i Hunan Provinsielle Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 til XZ). Forfatterne også erkjenner vitenskapelige bidrag av Dr. Dominic M. Desiderio i Universitetet i Tennessee Health Science Center. X.Z. kontinuerlig utviklet og brukt 2DE-MS metoder til å analysere hypofysen adenom proteom fra 2001, unnfanget konseptet for nåværende manuskriptet, skrev reviderte manuskriptet, koordinert relevant arbeidet og var ansvarlig for den økonomisk støtte og tilsvarende arbeid. Y.L. deltok i revisjon av manuskriptet. Y.H deltok i innhenting av referanser og revisjon av manuskriptet. Alle forfattere godkjent siste manuskriptet.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
