אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום
Summary
כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג’ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.
Abstract
גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי (PA) הוא גידול נפוצה המתרחשת ב בלוטת יותרת המוח האנושי במערכות ציר היפותלמוס-יותרת המוח-ממוקד איברים, והוא עשוי להיות מסווגת כ- PA או פונקציונלי קלינית או מתפקד (FPA ו- NFPA). NFPA קשה לאבחון בשלב מוקדם וטיפול בשל בקושי היא מרוממת הורמונים בדם בהשוואה FPA. מטרתנו לטווח ארוך היא להשתמש בשיטות פרוטאומיקס כדי לגלות סמנים ביולוגיים אמין עבור הבהרה של המנגנונים המולקולריים הרשות הפלשתינית והכרה של סמנים אבחון, prognostic יעילה לבין מטרות טיפוליות. יעיל דו-ממדית בג’ל (2DE) בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה (MS) הוצגו כאן כדי לנתח את האדם proteomes הרשות הפלסטינית, כולל הכנת דוגמאות דו-ממדית בג’ל, חלבון ויזואליזציה, ניתוח תמונות, בג’ל עיכול טריפסין, פפטיד המוני טביעות אצבע (PMF) וטנדם מסה ספקטרומטר (MS/MS). 2-ממדי ג’ל אלקטרופורזה לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון ספקטרומטר מסה PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS ופרוצדורות MS/MS 2DE נוזלי כרומטוגרפיה (LC) בהצלחה יושמו ניתוח של NFPA פרוטאום. עם השימוש של ספקטרומטר מסה רגישות גבוהה, חלבונים רבים זוהו עם שיטת 2DE-LC-MS/MS כל ג’ל 2D במקום ניתוח של רקמות מורכבות הרשות הפלסטינית כדי למקסם את הכיסוי של האדם פרוטאום הרשות הפלסטינית.
Introduction
הרשות הפלסטינית הוא גידול נפוצה המתרחשת ב בלוטת יותרת המוח האנושי במערכות ציר היפותלמוס-יותרת המוח-ממוקד איברים, ממלאים תפקיד חשוב במערכת האנדוקרינית האנושית. הרשות הפלסטינית כולל קלינית ולא פעולות PAs (FPA ו- NFPA)1,2. NFPA קשה לאבחון בשלב מוקדם, טיפול בגלל רמות ההורמונים רק מעט יותר גבוהה מהרגיל (למשל, LH ו- FSH) בדם בהשוואה FPA, המגדילה באופן משמעותי את רמות של הורמונים המתאימים דם3,4 ,5. ההבהרה של המנגנונים המולקולריים וגילוי של סמנים ביולוגיים יעיל יש משמעות קלינית חשוב באבחון, טיפול, ולאחר הפרוגנוזה של NFPA. מטרתנו לטווח ארוך היא לפתח להשתמש בשיטות פרוטיאומיה מבנית ללמוד NFPA גילוי סמנים ביולוגיים אמין כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שלה ושל לזהות מטרות טיפולית יעילה, כמו גם סמנים אבחון ו prognostic. 2-DE בשילוב עם שיטות MS היו בשימוש נרחב בתוכנית מחקר ארוך טווח שלנו לגבי האדם הרשות הפלסטינית פרוטאום1,2,6,7, כולל הקמת פרוטאום הפניה מפות3,8, ניתוח של חלבון באופן שונה ביטוי פרופילים9,10,11,12,13, הורמון גרסאות14 ,15, שינויים post-translational כגון זרחון14 וטירוזין ניטרציה16,17,18, הווריאציות פרוטיאומיה מבנית של פולשני יחסית NFPAs לא פולשנית19, והטרוגניות פרוטיאומיה מבנית של NFPA יחוברו13, אשר הוביל אל הגילוי של ריבוי רשתות מסלול חשוב (תפקוד מיטוכונדריאלי dysregulation מחזור התא, סטרס חמצוני, MAPK איתות מערכת חריגות) זה שונו ב- NFPA13,19,20.
2DE מפריד חלבונים על פי שלהם נקודה איזואלקטרית (pI) (לגירויי כאב תוך התמקדות, הפורום הישראלי לאנרגיה), משקל מולקולרי (באמצעות סודיום dodecyl סולפט לזיהוי בג’ל, עמודים מרחביות)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. זוהי טכניקה קלאסית ומקובל ההפרדה בתחום פרוטאומיקס, מאז כניסתה של המושגים של פרוטאום ו פרוטאומיקס ב 199524. MS היא הטכניקה מכריע בשביל לגלות את זהותו של חלבונים מופרדת 2DE, כולל אסטרטגיות PMF ו- MS/MS. ההתפתחות המהירה מאוד של כלי MS, במיוחד בהיבטים של איתור רגישות ורזולוציה, בשילוב עם השיפור של מערכת LC, משפר באופן משמעותי את זהותו של חלבונים שפע נמוך או נמוך ביותר ב פרוטאום כדי למקסם סיקור פרוטאום. גם האתגרים שלנו מושגים מסורתיים שרק אחת או שני חלבונים הנמצאים במקום ניתוח של רקמות אנושיות מורכבות פרוטאום ג’ל דו-ממדי, ומספק הזדמנות לזהות חלבונים מרובים ב- 2D ג’ל במקום ניתוח של רקמות אנושיות מורכבות פרוטאום ולמקסם את הכיסוי של NFPA פרוטאום.
כאן נתאר הפרוטוקולים מפורט של PMF MS 2DE-MALDI, 2DE-MALDI MS/MS, ו 2DE-LC-MS/MS אשר שימשו בהצלחה בניתוח פרוטאום NFPA אנושי. הפרוטוקולים כוללים הכנה של דגימות, תחילה dimension (לגירויי כאב תוך התמקדות, הפורום הישראלי לאנרגיה), המימד השני (מרחביות-עמוד), ויזואליזציה של חלבונים (צביעת כסף, כחול Coomassie מכתים), ניתוח של ג’ל דו-ממדי, עיכול בג’ל טריפסין, תמונה טיהור של פפטידים tryptic, PMF, MS/MS מסד הנתונים כובש3,8,25,26. יתר על כן, פרוטוקול זה מתרגם בקלות לניתוח של אחרים proteomes רקמה אנושית.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE, בשילוב עם שיטות MS כולל PMF 2DE-MS ו- 2DE-MS/MS, שימש בהצלחה בתוכנית שלנו לטווח ארוך – השימוש פרוטאומיקס ללמוד האנושי NFPA פרוטיאומיה מבנית וריאציות ווריאציות רשת מולקולרית עבור הבהרה של המנגנונים המולקולריים ו גילוי של סמנים ביולוגיים יעיל עבור NFPAs. מבוסס על 2DE פרוטאומיקס השוואתית עם הפארמצבטית טו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (מענק מס ‘ 81572278 ו- 81272798 כדי XZ), המענקים של סין “863” תוכנית הפרוייקט (מענק מס ‘ 2014AA020610-1 כדי XZ), את הכספים בבית החולים Xiangya עבור הכישרון מבוא (XZ) של הונאן קרן מחוזי מדעי הטבע של סין (מענק מס 14JJ7008 כדי XZ). המחברים גם להכיר את התרומה המדעית של ד ר דומיניק מ Desiderio ב המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טנסי. X.Z. ברציפות פיתח, השתמשו בשיטות 2DE-MS כדי לנתח גידול בבלוטת יותרת המוח פרוטאום החל מ- 2001 הגה את הרעיון של היד, כתב, תוקן כתב היד, תיאם את העבודה הרלוונטי, היה אחראי תמיכה כספית, עבודה המתאימה. ובמקורות השתתפו תיקון של כתב היד. Y.H השתתף אוסף של הפניות, ובחינה של כתב היד. כל המחברים אישרה את כתב היד הסופי.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
