هلام ثنائي الأبعاد التفريد مقترنة بأساليب الطيف الكتلي لتحليل البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية
Summary
نقدم هنا، هلام ثنائي الأبعاد التفريد (2DE) مقترنة بالطيف الكتلي (مللي ثانية) لفصل وتحديد البروتين الأنسجة البشرية الورم الحميد الغدة النخامية، الذي يعرض نمط 2DE جيدة واستنساخه. ولوحظت العديد من البروتينات في كل بقعة 2DE عند تحليل البروتين السرطان معقدة باستخدام MS حساسية عالية.
Abstract
الورم الحميد الغدة النخامية البشرية (السلطة الفلسطينية) هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور تحت المهاد-النخامية-استهداف الجهاز، ويمكن أن تصنف السلطة الفلسطينية أما سريرياً وظيفي أو غير وظيفي (FPA و NFPA). ومن الصعب NFPA لمرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب بالكاد رفع مستوى الهرمونات في الدم بالمقارنة مع FPA. هدفنا طويل الأجل لاستخدام أساليب البروتيوميات لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح الآليات الجزيئية السلطة الفلسطينية والاعتراف بعلامات التشخيص، تشخيصية فعالة والأهداف العلاجية. هلام ثنائي الأبعاد فعالة التفريد (2DE) مقترنة بأساليب الطيف الكتلي (مللي ثانية) وعرضت هنا لتحليل البشرية بروتيوميس السلطة الفلسطينية، بما في ذلك إعداد العينات، التفريد جل 2D، التصور البروتين، وتحليل الصور، في جل الهضم التربسين وهضميد بصمة الشامل (تحلان) جنبا إلى جنب كتلة قياس الطيف الكتلي (MS/MS). هلام ثنائي الأبعاد التفريد الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز/التأين الكتلي تحلان (2DE–استخدام MS تحلان)، 2DE–استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد أو مرض التصلب العصبي المتعدد، والفصل اللوني السائل 2DE (LC) MS/MS الإجراءات التي طبقت بنجاح في تحليل البروتين NFPA. مع استخدام مطياف كتلة حساسية عالية، حددت العديد من البروتينات باستخدام أسلوب 2DE-LC-MS/MS في جل 2D كل بقعة في تحليل الأنسجة السلطة الفلسطينية معقدة تحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين البشري في السلطة الفلسطينية.
Introduction
السلطة الفلسطينية هو ورم شائعة التي تحدث في الغدة النخامية البشرية في النظم محور الجهاز تحت المهاد-النخامية-المستهدفة، التي تلعب أدواراً هامة في نظام الغدد الصماء الإنسان. وتشمل السلطة الفلسطينية سريرياً وظيفية ولا يعمل نظام تقييم الأداء (FPA و NFPA)1،2. NFPA أمر صعب في مرحلة التشخيص المبكر والعلاج بسبب مستويات الهرمون مرتفعة قليلاً فقط (مثلاً، LH و FSH) في الدم بالمقارنة مع FPA، الذي شهد زيادة كبيرة في مستويات الهرمونات المقابلة في الدم3،4 ،5. توضيح الآليات الجزيئية واكتشاف المؤشرات الحيوية فعالة له أهمية سريرية هامة في التشخيص والعلاج، والتكهن من NFPA. هو هدفنا طويل الأجل تطوير واستخدام أساليب البروتين لدراسة NFPA لاكتشاف المؤشرات الحيوية يمكن الاعتماد عليها لتوضيح آلياته الجزيئية، والاعتراف بالأهداف العلاجية الفعالة، فضلا عن علامات التشخيص وتنبؤاتها. 2-دي مقترنة بمرض التصلب العصبي المتعدد الأساليب قد استخدمت على نطاق واسع في برنامجنا البحوث طويلة الأجل فيما يتعلق بالإنسان السلطة الفلسطينية البروتين1،2،،من67، بما في ذلك إنشاء مرجع البروتين خرائط3،8، تحليل البروتين الأثران عن ملامح9،10،11،12،13، المتغيرات هرمون14 ،15، التعديلات بوستترانسلاشونال مثل الفسفرة14 وتيروزين نترته16،،من1718، واختلاف البروتين الغازية نسبة إلى موسع نفباس19، وإلى عدم تجانس البروتين NFPA الأنواع الفرعية13، مما أدى إلى اكتشاف عدة شبكات المسار الهام (خلل mitochondrial والتقلبات دورة الخلية، والأكسدة، وإشارات MAPK شذوذ النظام) التي يتم تغييرها في NFPA13،،من1920.
2DE يفصل البروتينات وفقا isoelectric نقطة (pI) (تركز isoelectric، الضمنية) والوزن الجزيئي (عن طريق الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام التفريد، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)1،2،3، 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23-هذا أسلوب فصل الكلاسيكي ومشتركة في ميدان البروتيوميات، منذ الأخذ بمفاهيم البروتين والبروتينات في 199524. مرض التصلب العصبي المتعدد هو الأسلوب حاسمة لمعرفة الهوية البروتينات المفصولة 2DE، بما في ذلك استراتيجيات تحلان و MS/MS. التطور السريع جداً لمرض التصلب العصبي المتعدد الصكوك، لا سيما في الجوانب للكشف عن حساسية والقرار، في تركيبة مع تحسين نظام LC، يحسن إلى حد كبير هوية البروتينات وفرة منخفضة أو منخفضة للغاية في البروتين إلى أقصى حد ممكن تغطية البروتين. كما أنه يتحدى مفاهيمنا التقليدية واحدة فقط أو اثنين من البروتينات موجودة في 2D هلام موضعي في تحليل البروتين الأنسجة البشرية المعقدة، ويوفر فرصة للتعرف على البروتينات متعددة في 2D هلام موضعي في تحليل الأنسجة البشرية المعقدة البروتين، وتحقيق أقصى قدر من التغطية للبروتين NFPA.
هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة من 2DE–استخدام MS تحلان، 2DE–استخدام MS/MS، و 2DE-LC-MS/MS التي استخدمت بنجاح في تحليل البروتين NFPA البشرية. البروتوكولات وتشمل إعداد العينات، البعد الأول (isoelectric التركيز، الضمنية)، البعد الثاني (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة)، تصور بروتينات (تلطيخ الفضة وتلطيخ أخذ الأزرق)، صورة التحليل في 2D هلام، التربسين في جل الهضم، تنقية الببتيدات تريبتيك وتحلان، MS/MS، وقاعدة بيانات الحارقة3،8،،من2526. وعلاوة على ذلك، يترجم هذا البروتوكول بسهولة لتحليل بروتيوميس الأنسجة البشرية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE، إلى جانب أساليب مرض التصلب العصبي المتعدد بما في ذلك تحلان 2DE MS و 2DE–MS/MS، وقد استخدمت بنجاح في برنامجنا الطويل الأجل–استخدام البروتينات لدراسة البشرية NFPA البروتين الاختلافات والتباينات الشبكة الجزيئية للكشف عن الآليات الجزيئية و اكتشاف المؤشرات الحيوية الفعالة نفباس. 2DE المستندة البر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81572278 و 81272798 إلى XZ)، والمنح من الصين “863” خطة المشروع (رقم المنحة 2014AA020610-1 إلى XZ) وأموال مستشفى إكسيانجيا “المواهب مقدمة” (XZ)، وفي هونان مؤسسة العلوم الطبيعية المقاطعات في الصين (رقم المنحة 14JJ7008 إلى XZ). الكتاب أيضا تعترف بالمساهمة العلمية للدكتور دومينيك م. ديسيديريو في مركز العلوم الصحية في جامعة تينيسي. X.Z. باستمرار نمواً وتستخدم أساليب 2DE–مرض التصلب العصبي المتعدد لتحليل البروتين الورم الحميد في الغدة النخامية بدءاً من عام 2001 وتصور المفهوم للمخطوطة الحالية وكتب وتنقيح المخطوط، تنسيق العمل ذات الصلة وكان مسؤولاً عن الدعم المالي والعمل المناظرة. وشارك Y.L. في مراجعة المخطوطة. وأي إتش شاركت في مجموعة من المراجع، ومراجعة المخطوطة. ووافق جميع المؤلفين المخطوط النهائي.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
References
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
