إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة
Summary
نموذج حيوان ضروري لفك دور تعميم الخلايا السرطانية (ريادية) في تعزيز استعمار الرئة أثناء سرطان خبيث. هنا، قمنا بإنشاء وتنفيذها بنجاح في فيفو الاعتداء على وجه التحديد اختبار اشتراط الجمعية فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) على ريادية لاستعمار الرئة.
Abstract
ورم خبيث هو السبب الرئيسي للوفاة من السرطان. دور تعميم الخلايا السرطانية (ريادية) في الترويج لسرطان خبيث، الذي يساهم في الرئة الاستعمار ريادية خطيرة على عمليات المنتشر الرئة المبكر، تم التحقيق بشدة. على هذا النحو، النماذج الحيوانية هي النهج الوحيد الذي يلتقط عملية منهجية كاملة لورم خبيث. نظراً لأن المشاكل تحدث في التصاميم التجريبية السابقة لدراسة إسهامات ريادية للتسرب الأوعية الدموية، قمنا بإنشاء في فيفو الرئة استعمار مقايسة التي طويلة الأجل-الأسفار الخلية-الراسم، كاربوكسيفلوريسسين إستر سوكسينيميديل (CFSE)، تم استخدامه لتسمية الخلايا السرطانية مع وقف التنفيذ، وقد أنجز نضح الرئة لمسح غير تحديداً المحاصرين ريادية قبل إزالة الرئة والتصوير [كنفوكل]، والتقدير الكمي. تم العثور على فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) اجتمعنا للأسطح لجنة مكافحة الإرهاب التوسط من أجل استعمار الرئة في النهائي إنشاء أنسجة الورم المنتشر. وهنا على وجه التحديد اختبار شرط الجمعية بوليفن على ريادية لاستعمار الرئة والتسرب، أجرينا قصير فحوصات الرئة الاستعمار التي علقت خلايا سرطان الرئة لويس (المسئولية) ستابلي معربا عن الجبهة الوطنية-شرنا (شفن) أو التدافع-شرنا (شسكر) والمسمى مسبقاً مع 20 ميكرو كفسي تم تلقيح عن طريق الوريد في الفئران C57BL/6. أننا نجح في إثبات أن قدرات شفن LLC الخلايا لاستعمار الرئتين الماوس تتضاءل إلى حد كبير بالمقارنة مع الخلايا شسكر LLC. ولذلك، هذه المنهجية القصيرة الأجل قد تطبق على نطاق واسع لإثبات قدرة ريادية داخل الدورة الدموية لاستعمار الرئتين على وجه التحديد.
Introduction
ورم خبيث هو السبب الرئيسي للسرطان الموت1،2. أدخل على تداول في تعليق الخلايا السرطانية المستمدة من الأنسجة الأولية والبقاء على قيد الحياة مختلف عن التحديات، مثلاً، anoikis، ومحصنة ضد الاعتداءات والأضرار نتيجة لإجهاد القص من ضغط الدم أو القيود هندسية، قبل أن تكون القدرة على استعمار الأجهزة البعيدة، خطوة أساسية في إملاء نجاح خبيث3،4،،من56. ولذلك، قد حاليا تم بذل جهود نشطة في تميز الخلايا السرطانية المتداولة (ريادية) وربط هذه الخصائص مع الورم الخبيث، وورم خبيث، ومعدلات البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان7،8 , 9-منذ عملية سرطان خبيث على وجه التحديد يصور حدثاً في فيفو ، نماذج حيوانية هي النهج الوحيد الذي يلتقط عملية منهجية كاملة لورم خبيث10،11،12 .
تصبح ريادية أنسجة الورم المنتشر من خلال أحداث الخلوية متعددة بما في ذلك استعمار الأجهزة البعيدة1،2. ومع ذلك، لا توفر خبيث الأكثر استخداماً فحوصات13،،من1415 وسيلة لمراقبة لجنة مكافحة الإرهاب استعمار الأجهزة البعيدة. ولذلك، حاجة ملحة في فيفو مقايسة تصميم للتصور الاستعمار لجنة مكافحة الإرهاب. على الرغم من أن عدة في فيفو و السابقين فيفو قصيرة الأجل الرئة الاستعمار وقد تم تصميم الاختبارات ومشاكل وعيوب تظل. على سبيل المثال، بينما البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)-فحوصات overexpressing ورم الخلايا التي استخدمت في هذه،من2223، ويستغرق وقتاً ستابلي ترانسفيكت واستنساخ الخلايا السرطانية مع كافية شدة الفلورسنت بروتينات فلورية خضراء تحت المجهر. وبالمثل، قد استخدمت تلطيخ عابر للخلايا السرطانية مع الراسم خلية طويل الأجل كفسي ليحل محل الخلايا السرطانية معربا عن التجارة والنقل، ولكنها لا تزال صعوبة في الحكم على ما إذا كانت خلايا السرطان المسمى كفسي مرفقة أو مجرد موجودة داخل المفرج من ال16،الأجهزة البعيدة قصت17.
تم العثور على فيبرونيكتين البوليمرية (بوليفن) المجمعة على أسطح ريادية المساهمة حاسمة في إقامة النهائي للورم المنتشر الأنسجة18،19،،من2021،22 . هنا، نحن إجراء قصير تم تلقيح الرئة الاستعمار فحوصات في أي تعليق لويس خلايا سرطان الرئة (المسئولية) ستابلي معربا عن الجبهة الوطنية-شرنا (شفن) أو التدافع-شرنا (شسكر) والمسمى مسبقاً مع كفسي عن طريق الوريد في الفئران C57BL/6. بعد 2-3 أيام، كانت أول perfused الرئتين الماوس مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة فاتحة ريادية ضمن المفرج قبل أن يتعرض للفحص المجهري [كنفوكل] والتحديد الكمي لاستعمار الرئة المسئولية. لقد تبين بوضوح أن أعدادا من استعمار الرئة شفن المسئولية والعقيدات الورم خفضت إلى حد كبير بالمقارنة مع شسكر المسئولية، مساندة دور الجمعية بوليفن على ريادية إلى حد كبير في تسهيل الاستعمار ونمو ريادية في الرئتين. دراستنا يستحق مزيدا من التحقيق للدور بوليفن في سرطان خبيث.
Protocol
Representative Results
Discussion
جنبا إلى جنب مع طويلة الأجل الرئة الاستعمار فحوصات، على المدى القصير المنهجية المتبعة ونحن هنا لتقييم الاستعمار في فيفو الرئة بريادية في الأجهزة البعيدة كشفت بوضوح ويميز الدور المحدد لتجميعها في ريادية في استعمار بوليفن الرئتين، مما أدى بعد ذلك إلى التسرب وعمليات المنتشر1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر الدكتور تشانغ مينغ-مين والسيدة تشنغ هسين-يا لتقديم الدعم التقني لهم. هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان (معظم-103-2325-ب-006-009، ومعظم-104-2325-ب-006-001، معظم-105-2325-ب-006-001، و MOST-106-2320-B-006-068-MY3) ووزارة الصحة والرعاية الاجتماعية (MOHW106-TDU-ب-211-144004). نحن ممتنون أيضا للدعم من “مختبر البحوث الأساسية” لكلية الطب، جامعة تشينغ كونغ الوطنية، مجهر [كنفوكل] فوتون متعددة.
Materials
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. Emerging Biological Principles of Metastasis. Cell. 168 (4), 670-691 (2017).
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells – mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
