Summary
במודל חיה יש צורך לפענח את התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום קולוניזציה ריאות במהלך גרורות סרטן. . הנה, הקמנו, לבצע בהצלחה של ויוו assay לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבה fibronectin פולימריים (polyFN) על CTCs ריאות קולוניזציה.
Abstract
גרורות הוא הגורם העיקרי של מקרי המוות מסרטן. התפקיד של מחזורי תאים סרטניים (CTCs) בקידום גרורות סרטן, שבו הריאות קולוניזציה על-ידי CTCs אנושות תורם לתהליכים מוקדם ריאות גרורתי, נחקר נמרצות. ככזה, מודלים בעלי חיים הם הגישה היחידה כי לוכדת את תהליך מערכתי מלא של גרורות. בהתחשב בכך להתרחש בעיות קודמות עיצובים ניסיוני לבחינת התרומות של CTCs כדי extravasation כלי דם, הקמנו ויוו ריאות קולוניזציה assay שבו תא-מעקב ארוך-טווח-זריחה, carboxyfluorescein succinimidyl אסתר (CFSE), שימש לה תווית תאים סרטניים מושעה, זלוף ריאות בוצע כדי לנקות הלא ספציפית לכוד CTCs לפני הסרת הריאה, הדמיה קונאפוקלית ו כמת. Fibronectin פולימריים (polyFN) התאספו על משטחים CTC נמצאה לתווך ריאות קולוניזציה בהקמה הסופי של רקמות גידול גרורתי. . כאן, כדי לבדוק באופן ספציפי את הדרישה של הרכבות polyFN CTCs ריאות קולוניזציה, extravasation, ביצענו לטווח קצר ריאות מבחני קולוניזציה שבו הושעה לואיס ריאות קרצינומה של תאים (LLCs) stably לבטא FN-shRNA (shFN) או לטרוף-shRNA (shScr) ומתויגים מראש עם 20 μM של CFSE חוסנו לווריד לתוך עכברים C57BL/6. בהצלחה להדגים היכולות של shFN LLC תאים ליישב הריאות העכבר היו פחתה באופן משמעותי בהשוואה shScr LLC תאים. לכן, מתודולוגיה לטווח קצר זו עשוי להיות מיושם באופן נרחב להפגין באופן ספציפי את היכולת של CTCs בתוך מחזור הדם ליישב את הריאות.
Introduction
גרורות הוא הגורם העיקרי של סרטן מוות1,2. תאים סרטניים נגזר רקמות הראשי להזין את זרימת הדם ההשעיה ולשרוד שונים אתגרים hematogenous למשל, anoikis, התקפות מערכת החיסון, נזקים עקב מאמץ גזירה לחץ דם או אילוצים גיאומטריים, לפני שהם אפשרות ליישב איברים רחוקים, צעד. מפתח מכתיב את ההצלחה של גרורות3,4,5,6. לכן, נמרצת כרגע נעשו מאמצים איפיון תאים סרטניים במחזור (CTCs), מתאם מאפיינים אלו עם גידול ממאיר, גרורות, שיעורי ההישרדות של סרטן המטופלים7,8 , 9. מאז התהליך של גרורות סרטן במיוחד מתארת אירוע ויוו , מודלים בעלי חיים הם הגישה היחידה כי לוכדת את תהליך מערכתי מלא גרורות10,11,12 .
CTCs הופכים גידול גרורתי לרקמות דרך הסלולר אירועים מרובים כולל הקולוניזציה של איברים רחוקים1,2. עם זאת,14,15 13,מבחני גרורות הנפוצות ביותר אינם מספקים דרך להתבונן CTC קולוניזציה של איברים רחוקים. לכן, עיצוב assay ויוו להמחשת קולוניזציה CTC דרוש בדחיפות. למרות מספר ויוו , שמחוץ קצר לטווח הריאה קולוניזציה מבחני עוצבו, בעיות, חסרונות נשארים. למשל, בעוד חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP)-מבחני overexpressing גידול תאים השתמשו באלה22,23, זה לוקח זמן stably transfect, לשכפל תאים סרטניים בעוצמה מספקת GFP פלורסנט תחת המיקרוסקופ. באופן דומה, למרות מכתים ארעית של תאים סרטניים עם חיצי מעקב התא לטווח ארוך CFSE ננקטה כדי להחליף את תאי הגידול לבטא-GFP, זה נשאר קשה לשפוט אם בתאי הגידול התווית על-ידי CFSE מחוברים או סתם מתנה בתוך להערכת מתוך16,נכרת איברים רחוקים17.
Fibronectin פולימריים (polyFN) התאספו על משטחים של CTCs נמצאה לתרום באופן ביקורתי הממסד הסופי של גידול גרורתי רקמות18,19,20,21,22 . כאן, נוכל לבצע לטווח קצר ריאות קולוניזציה מבחני שבו תנאי לואיס ריאות קרצינומה של תאים (LLCs) stably FN-shRNA (shFN) או לטרוף-shRNA (shScr) ומוענקת לו מראש CFSE חוסנו לווריד לתוך עכברים C57BL/6. לאחר 2-3 ימים, הריאות העכבר היו קודם perfused בתמיסת פוספט buffered (PBS) כדי להסיר לחלוטין את CTCs כעיגולים בצבע בתוך להערכת לפני נתון מיקרוסקופיה קונפוקלית, כימות של הריאות-להמדינות LLCs. אנחנו הראו בבירור המספרים של הריאות-להמדינות shFN LLCs ואת הגידול גושים הצטמצמו באופן משמעותי בהשוואה shScr LLCs, באופן משמעותי מאמתים את התפקיד של הרכבות polyFN CTCs בקידום קולוניזציה של צמיחה של CTCs ב הריאות. המחקר שלנו דורש עוד חקירה לתפקיד של polyFN של גרורות סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים על עכברים בוצעו בהתאם לקווים המנחים של המכון שלנו (המדריך לקבלת טיפול, שימוש של חיות מעבדה, המכללה לרפואה NCKU).
1. הכנת כלי נגינה, תרבות המדיה ומנות
- לפני שמתחילים את הפרוטוקולים ניסיוני, להשיג את התפרים כירורגי סטרילי, 1 מ"ל מזרקים עם מחט 26G/0.5 ס מ (על הזנב זריקה לווריד), 3 mL מזרקים עם המחט 24G/3 ס מ (עבור זלוף הריאה), של Dulbecco ששינה נשר מדיה (DMEM), טריפסין-EDTA פתרון (5 טריפסין g/L ו מ מ 0.53), סרום שור עוברית (FBS), PBS x 1 (137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2PHO4ו2PO 1.8 מ מ ח'4) ומנות תרבות 6 ס מ.
2. הכנה ושחזור של תאים סרטניים ההשעיה
- הכן של Dulbecco סטרילי ששינה נשר מדיה (DMEM) המכיל 10% או 20% FBS טרי להוסיף 2 מ מגלוטמין, 1 x PBS ו- 0.05% טריפסין-EDTA.
- התרבות התאים DMEM בתוספת 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס ואגדל אותם עד 70-80% הנהרות בצלחת תרבות.
- הסר את המדיה התרבות (DMEM) הכלים, ואחריו שני שוטף עם 2 מ של PBS עקר 1 x.
- להוסיף 1 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הכלים לכסות ביסודיות את כל התאים. מיד להסיר μL 800 של פתרון ולהשאיר רק 200 μL ב הכלים. דגירה כל המנות של 37 ° C ל 30 s 1 דקות (בהתאם לסוג התא) וחכי עד רוב התאים המצב המושהה.
- להוסיף 1 מ"ל של טרי DMEM המכיל 10% FBS ישירות לתוך הכלים כדי לעצור את הפעילות האנזימטית מתרחשת של טריפסין, נמרצות pipette התליה תא למעלה ולמטה עם פיפטה 1000 µL להכין השעיה תא בודד.
- להעביר את התאים המנה צינור microcentrifuge 1.5 mL, ספין למטה התאים בטמפרטורת החדר ב g x 162 למשך 3 דקות.
- וארוקן את תגובת שיקוע וסובב resuspend תאי הגידול 1.5 mL DMEM המכיל 20% FBS ו מעל קצה-התאים ההשעיה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
הערה: אם המדיום לצהוב במהלך ההתאוששות, להחליף את המדיום הישן בינונית טרייה המכיל 20% FBS.
3. קרינה פלואורסצנטית מכתים וניתוח של תאים סרטניים ההשעיה עם אסתר Succinimidyl Carboxyfluorescein (CFSE)
- לאחר שחזור תא ההשעיה, ספירת המספרים המתאימים תא קיימא עם Trypan Blue ב נויבאואר סופר תא titrating על ידי קרינה פלואורסצנטית מכתים מינונים, על הזנב הווריד הזרקה.
- ספין למטה התאים ב g 162 x בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות ו- resuspend שתאי pelleted 1 מ"ל של עיקור PBS x 1, ואחריו צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב g x 162 למשך 3 דקות.
- Resuspend תאי pelleted µL 500 ל- PBS X 1 המכיל 10% FBS ו- 0, 5, 10, 20 או 40 µM CFSE עבור טיטור במינון, דגירה התליה תא ב 37 oC למשך 10 דקות בחושך.
- ספין למטה התאים ב g x 162 בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות, resuspend את התאים pelleted עם 4 מיליליטר DMEM המכיל 1% FBS. חזור על שלב כביסה זה עוד שלוש פעמים. Resuspend התאים pelleted עם 4 מ של DMEM לבד בשביל הכביסה הסופי.
- נושא התאים התווית על-ידי CFSE תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) ניתוח כדי לכמת את עוצמת קרינה פלואורסצנטית של תא בודד, או זנב בהזרקה לווריד.
הערה: לשמור את התאים על הקרח לפני שתבצע את הזריקות וריד FACS ניתוח או זנב.
4. ריאות קולוניזציה Assay
- להכין את התאים המסומנת 20 מיקרומטר CFSE (עיין 3.1 שלבים דרך 3.4).
הערה: להחליט את המינון עבודה של CFSE עבור תוויות תאים סרטניים, בהתבסס על תוצאות טיטור מניתוח FACS (עיין שלב 3.3). - חממו הזנב של שבוע 4-6-בן זכר C57BL/6 עכברים (עכברים 6) עם מנורה הליד למשך 5-10 דקות על בסיס עכבר-מאת להתרחב ורידים זנב העכבר.
- ביסודיות לערבב, תשאף תאים סרטניים התווית על-ידי CFSE עם מזרק 1 מ"ל (26Gx1/2), הימנעות בועות ההשעיה תא (עם צפיפות תא הסופי של 5 x 106 תאים למ"ל).
- בזהירות להזריק 1 x106 תאים סרטניים התווית על-ידי CFSE ב 200 µL של DMEM לווריד זנב העכבר, אשר צריך להיות תקוע ב- restrainer העכבר.
הערה: במהלך הזריקה, אם המחט ממוקם ישירות לומן של הווריד של הזנב, תאים סרטניים בקלות תישלח למחזור ללא צורך ללחוץ חזק על המזרק. אם זה קשה לדחוף לתאי הגידול דרך, הם יש ככל הנראה הוזרק מחוץ הווריד הזנב, לחלל התת עורית. - לחלק את העכברים שקיבלו לווריד לתאי הגידול התווית על-ידי CFSE לשתי קבוצות: קבוצה אחת יעבור זלוף הריאות ולאחריו מיקרוסקופיה קונפוקלית, ImageJ כמת וזמינותו קולוניזציה ריאות ו השני יישאר לבד במשך 4-5 שבועות ב הקולוניזציה ריאות לטווח ארוך וזמינותו.
- 20, 38 או 45 h ועם עונה 1 פרק 106 תאים סרטניים מוזרק לווריד במהלך טיטור קורס ותלוי במינון פעם, עזים ומתנגד נושאות עכברים עם 50-75 מ"ג/ק"ג zoletil 50, אשר הוא anesthetizer היטב מקובל ונכון23.
הערה: השתמש משחה הוטרינר על העיניים של העכברים למניעת יובש תחת הרדמה. - Longitudinally לחתוך את העור, רקמות תת עוריות מהבטן באזור החזה עם מספריים כירורגיים. פתח את חלל הצדר עם מספריים כירורגיים ומלקחיים לחשוף באופן מלא את הלב והריאות.
הערה: להיות זהירים כדי למנוע ניתוק כלי הדם. - לקשור את הווריד הנבוב מעולה (SVC) ואת הכלילי (IVC) עם התפרים כירורגי סטרילי כדי למנוע את זרם אחורי של פתרון זלוף במהלך ריאות זלוף.
- לחתוך קיר החדר השמאלי עם מספריים כירורגיים כדי לפתוח סדק (בערך 2-4 מ"מ) כדי לנקז את הפתרון זלוף מהריאות.
- להזריק 1 x PBS לתוך החדר הימני עם מזרק 3 מ ל ולהסיר את הפתרון סחוט עם שאיבה קבועה במהלך ריאות זלוף עד הריאות לפנות מן צבע אדמדם חיוורת לחלוטין.
5. קונאפוקלית הדמיה מיקרוסקופיים וניתוח של תאים סרטניים התנחלו ריאות
- להסיר את הריאות עכשיו-חיוור חלל הצדר, נפרדות האונות חמש על ידי חיתוך משם את הרצועות קנה הנשימה ואת רקמת חיבור עם מספריים, מלקחיים כירורגיים24.
- להכין בעל ריאות כמו אלונקה כפי שמוצג באיור 3B על ידי סלילה בתפר ניילון סביב שני מוטות מתכת כדי ליצור מרקם reticulate עם רווח בין שני מוטות את המיקום של אונות הריאה. להגדיר את הריאה. מחזיק מנה 6 ס מ.
הערה: בעל ריאות ישמש כדי לייצב את אונות הריאה מתחת לעדשה המטרה של מיקרוסקופ קונפוקלי. - Lodge ולתקן את אונות ריאה את המרקם reticulate של בעל ריאות. מכסה, להרטיב את אונות הריאה עם 1 x PBS.
- נושא המנה 6 ס מ תרבות מחסה האונות ריאות על בעל ריאות כדי מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי ללכוד תמונות פלורסצנטיות הקלטה לתאי הגידול ריאות-להמדינות.
- עבור הדמיה, להשתמש עדשות אובייקטיבי (5 X, MPLN, נה: WD 0.1,: 20, אוויר).
- סובב את גלגל מסנן כדי NIBA (עירור/פליטה; 470-495 ננומטר/510-550 ננומטר) ולהשתמש 488 ננומטר לייזר כדי לעורר CFSE, בבירור להמחיש תמונות של קרינה פלואורסצנטית נקודות בהאונות ריאות.
- סובב את גלגל מסנן כדי R690 (עבור MaiTai HP DeepSee לייזר) לסרוק עם 2.0 µs/פיקסל סריקה מהירות ולמטב את HV רווח, היסט רמות.
- לכידת תמונות קרינה פלואורסצנטית (512 x 512 פיקסלים) באמצעות התוכנה מיקרוסקופ עם 10 µs/פיקסל סריקה מהירות.
- לכמת ולנתח מבחינה סטטיסטית תמונות מיקרוסקופיות באמצעות תוכנת ImageJ GraphPad כמו שתואר לעיל21.
6. ארוכות מבחני קולוניזציה ריאות
הערה: חזור על שלבים 4.1 דרך 4.5.
- להקריב את העכברים לאחר חיסון תאי הגידול במשך 4-5 שבועות ולתקן את הריאות שלהם עם הנוזלים של Bouin25 במשך 1-2 ימים.
- לכמת ולנתח מבחינה סטטיסטית הגושים הגידול מהריאות עכברים עם תוכנה21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
לפני שתבצע ויוו ריאות קולוניזציה וזמינותו כמופיע ב איור 1A כדי לבדוק אם polyFN על תאים סרטניים מושעה שמתווכת קולוניזציה ריאות ו/או extravasation בקידום גרורות, אנחנו קודם, טיטרציה שונים ריכוזי CFSE, תרכובת פלורסנט תא חדיר, covalently conjugates תאיים amine המכילים מולקולות26,27 בתאי הגידול מושעה ונותרה בתאים במשך תקופה ארוכה של זמן. . מצאנו את הגידול הזה התאים הודבקו תוויות ביעילות עם CFSE באופן תלוי מינון, כמו מאויר ב איור 1B. CFSE-תיוג 6 x105 LLC תאים למ"ל הגיעו כמעט מישור ב 20 מיקרומטר כמו מאויר באיורים איור 1C.
בשל שפע הצרת נימי המערכת אשר פיזית עלול לעכב את הזרימה של CTCs בתוך להערכת הריאות, ביצענו זלוף בעכברים הנושאת מוזרק לווריד הריאה התווית על-ידי CFSE LLC לתאים ברור הלא ספציפית לכוד CTCs, כמו מאויר באיורים איור 1A לפני הסרת הריאה בכל נקודה בזמן כפי שהיא מתוארת באיור 4. לפני זלוף, הריאות היו בבירור אדמדם בשל נוכחותם של דם, כמופיע ב פאנל שמאלי של איור 2. הריאות הפך חיוור לאחר זלוף עם 10-15 מ של 1 x PBS, כמופיע פאנל נכון של איור 2.
מיד לאחר הריאות העכבר perfused הוסרו מן המרחב פלאורלי, האונות ריאות היו מופרדים, רכוב על בעל ריאות להציב במנות כמופיע ב- 3A איור עם PBS x 1 ביסודיות המכסים את אונות הריאה. האונות ריאות רכוב על בעל ריאות כמופיע ב- 3B איור היו נתון מיקרוסקופ קונפוקלי פלורסצנטיות כמופיע באיור 3 א. לתאי הגידול התווית על-ידי CFSE colonizing הריאות היו עם תמונה כמופיע ב פאנל עליון של איור 3C הפכו תמונות בשחור-לבן, כמופיע ב פאנל התחתונה של איור 3C כדי להקל על כימות של קולוניזציה ריאות עם התמונה J תוכנה.
אנחנו מוזרק לווריד תאים LLC או shScr או shFN, היו עם 20 מיקרומטר CFSE תוויות, חיכה קורס זמן של 24-72 שעות לפני ביצוע perfusions ריאות והדמיה מיקרוסקופיים קונפוקלי. כימות של הגידול ריאות-להמדינות התאים בעכברים 6 כמופיע ב איור 4A עם תוכנת ImageJ חשף כי באופן משמעותי פחות תאים LLC shFN מאשר shScr LLC תאים נספרו 38 h ו 45 h נקודות זמן, כמו מאויר באיורים איור 4B . הסיבה למה המספרים של shScr התנחלו ריאות וגם shFN LLC תאים התמעטו היה קרוב לוודאי עקב cytotoxicity רציף שהופעל על ידי שהדם חסינות גם מפני התאים LLC כבר להפקר. בסך הכל, תוצאות אלו מציע את polyFN התאספו על CTCs נדרשת אכן מתווכים קולוניזציה הריאה על ידי LLC תאים, שמוביל מלא גרורות בריאות כפי בתוצאות אילו עכברים לווריד קבלת aliquots של התווית על-ידי CFSE shScr, shFN LLC תאים עבור מבחני קולוניזציה הריאה כמופיע באיור 4 נותרו aloneuntil ריאות הגידול גושים פותחה בשנת וזמינותו גרורות הגידול ניסיוני כמופיע באיור 5A ו- 5B.
איור 1: טיטור של ריכוז CFSE עבור תיוג גידול בתאי ריאות קולוניזציה וזמינותו. (א) איור סכמטי של נהלי וזמינותו קולוניזציה הריאות ואת וזמינותו גרורות ניסיוני כמפורט בסעיף פרוטוקולים. (B) FACS ןועברל עוצמות קרינה פלואורסצנטית CFSE של תאים LLC, כי היו צבעונית עם ריכוזים שונים של CFSE. (ג) עוצמות קרינה פלואורסצנטית שורטטו כפונקציות של ריכוזים שונים של CFSE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הריאות לפני ואחרי זלוף. להחליפן בתמונות של הריאות לפני (unperfused; Unperf.) ואחרי (perfused; Perf.) מבצע ריאות זלוף. כוכב זהב: הלב. חץ לבן: העניבה סגורה של IVC/SVC. חצים אדומים: הריאות של העכבר אותו לפני ואחרי זלוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: הרכבה של האונות הריאה perfused-בעל ריאות על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה קונפוקלית- (א) בסכמה הריאות-גובר על בעל ריאות עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. (B) תמונת הנציגה של 3 אונות הריאה perfused-בעל ריאות. (ג) להחליפן בתמונות של תאים LLC ריאות-להמדינות עם CFSE זריחה על כימות J תמונה בתוכנות. פאנל עליון: הדמיה רגיל. החלונית התחתונה: הפוך הדמיה בשחור-לבן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: הזמן קורס הדמיה, כימות, ניתוח סטטיסטי של הריאה התנחלו תאים LLC shScr ו- shFN לאחר זלוף ריאות בריאות קולוניזציה וזמינותו. (א) נציג תמונות בשחור-לבן (המרה מתמונות קרינה פלואורסצנטית) של תאים LLC shScr ו- shFN, כי היו התנחלו ב להערכת הריאות בנקודות זמן שונות כמו שתוארו לאחר ריאות נרחב זלוף. קווים מנוקדים מציינות את הקצה של האזורים רקמת הריאה קונאפוקלית בפוקוס. (B) כימות וניתוח סטטיסטי עבור התאים LLC ריאות-להמדינות כמו דמיינו ב (א) לפי ממוצע של האונה מוחלטת נציג תמונות/ריאות 5/עכבר.... הערה: כל בר מציין את עוצמת קרינה פלואורסצנטית בממוצע של כל אזור קונאפוקלית בפוקוס. הנתונים היו סטטיסטית לבדיקה של העכברים 6, שדווח מתכוון ± SD; נ. ס אומר nonsignificant; * אומר p < 0.05; ו * * אומר p < 0.01; אנובה דו-כיווני. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: להשתיק FN ביטוי בתאים LLC התווית על-ידי CFSE פוחתת גושים סרטניים בריאות לטווח הארוך ב- vivo CTC קולוניזציה assay. הריאות העכבר נוזל-קבוע של (א) Bouin הנושאת גושים סרטניים נגזר התווית על-ידי CFSE shScr או shFN LLC תאים. (B) כמת, ניתוח סטטיסטי של הגושים גידול בריאות. נתונים מדווחים אומר ± SD; : p < 0.001; n = 6 לכל קבוצה; מבחן t אינטראקצית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יחד עם זמן לטווח הריאה קולוניזציה מבחני, לטווח הקצר מתודולוגיה אנחנו מועסק כאן כדי להעריך ויוו ריאות קולוניזציה מאת CTCs באיברים מרוחקים בבירור חשפה ו הבדיל את תפקיד ספציפי polyFN התאספו על CTCs להמדינות הריאות, אשר לאחר מכן הוביל extravasation ואת התהליכים גרורתי18,19,20,21. למרות תיוג תאים עם גשש תא לטווח ארוך CFSE מאפשרת לנו לאתר את CTCs מוזרק לווריד עד שלושה ימים לפני זלוף ריאות ולשמר פלורסצנטיות ירוקים מספקת למטרות כמותית, היה זה בלתי אפשרי לקבוע באופן ישיר אם תאים סרטניים היו בתוך לומן כלי או כבר extravasated של כלי הדם. כדי לפתור את זה בעיה, אדום פלורסנט לתוספי מצומדת rhodamine אשר מסוגל הלא ספציפית לאגד לקטינים לידי ביטוי endothelia עשוי לשמש כדי לתייג את להערכת הריאות במהלך ריאות זלוף28,29, 30. למרות העובדה כי CFSE הוא גשש תא לטווח ארוך, בעוצמתה פלורסצנטיות חצוי כל חלוקת התא27, הגבלת את הפוטנציאל של שימוש זה תיוג טכניקות. כדי לעקוף בעיה זו, זה צריך לקביעה כי המינון תיוג של CFSE מספיקה עבור תאים להישאר לזיהוי עבור ניסויים לכל משך ויוו , כי כל טיפול חלה על התאים אינו משפיע על התא התפשטות. כי השוואה של כימות של הריאות-להמדינות shScr, shFN CTCs נעשו בעכברים נפרדים, ניתן לטעון כי ההבדלים בין שתי הקבוצות היו בגלל וריאציה. כדי לא לכלול וריאציה כזו, תערובת של שני סוגי גידול התאים המסומנת ברורים לזרוח צבע (למשל, CFSE/ס מ- diI) או stably transfected עם GFP/dsRed עשוי להיות דרך הווריד/ת מוזרק לתוך אותה חיה ב הקולוניזציה ריאות assay31,32,33. ראוי לציין כי השיבוט תופעות הנובעות התא שיבוט בטכנולוגיה הוא ניסה לסדר stably תא transfected החלבון הניאון שיבוטים עם פלורסצנטיות חזק מספיק34,35, 36 , 37 עלולה להפוך את התאים משובטים מייצג לחלוטין כדי לייצג את אוכלוסיות הטרוגניות שלמות38,39,40. אם תרביות תאים יציב של כל חלבון פלואורסצנטי לתוך תאים סרטניים רצוי עבור מבחני קולוניזציה ריאות, היא מרוממת את היעילות תרביות תאים של תאי הגידול כולו צריך כדאי לשמור על המאפיינים המקוריים מאשר שכפול התא אוכלוסיות עם פלורסצנטיות מספיק41,42.
זלוף הריאות הצעדים הקולוניזציה ריאות מבחני נחוצים בכך כמה תאים סרטניים מוזרק לווריד, במקום לעצור באופן ספציפי למערכת נימי ריאות, נוטים להיות לכוד, נתקע בתוך רשתות נימי של הריאה רקמות עקב הקוטר averagely גדול של CTCs מאשר הרוחב של הריאה לומן נימי43,44. כימות של תאי הגידול ריאות-להמדינות ללא פרפוזיה הריאות עלול לגרום הערכה מופרזת על ידי בטעות ספירת תאים מכנית שנתקע46,45,, או47. גם אם יש כבר perfused את הריאות, נותרו בעיות נוספות. למשל, זה עדיין קשה להבחין בין אם לתאי הגידול ריאות-להמדינות נמצאים על endothelia lumenal או יש כבר extravasated של כלי הדם. כדי לפתור בעיה זו, מכתימה את כלי הדם עם Rhodamine מצומדת לתוספי כאמור עשוי להיות שימושי30,48,49. לחלופין, אם כימות של גידול extravasation רצוי, סידן-chelator EDTA/EGTA או טריפסין, פרוטאז שאינם ספציפיים, ניתן להשתמש במאגר זלוף כדי להכשיל תלויי סידן ועל - העצמאית גידול התא אדהזיה אירועי50 , 51 , 52. לפיכך, תאים סרטניים שנותרו ברקמות הריאה יכול להיחשב כפי extravasated.
על כימות של תאי סרטן ריאות-להמדינות, הריאות perfused נחשפים לעיתים קרובות כדי קונפוקלית מסורתיים. עם זאת, measurability של רקמת עומק מוגבל בחלקו בשל רקמת autofluorescence ואפקטים פלורסצנטיות פיזור, עיבוד עמוק יותר רקמות לא לגילוי53,54. מיקרוסקופ שני הפוטונים עם רגישות גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופ קונפוקלי מסורתי מתאימה לפתור בעיות כאלה כי הקרינה אינפרא אדום בשימוש שני הפוטונים עירור עם קליטה פחות משמעותית על ידי דגימות ביולוגיות מ- UV או אור כחול-ירוק הופך את הטכניקה מתאים יותר הדמיה דגימות עבה-55,-56,-57. ריאות-להמדינות תאים סרטניים נספרים על ידי חישוב ממוצע של מספרים תא הגידול במספר תמונות קונאפוקלית נציג, אשר אינם כוללים את כל המספר של הריאות-להמדינות תאים סרטניים בריאות שלמה בעל חיים בודדים. לכמת כל הריאות במבחני קולוניזציה הריאה, יכול להיות מועסק תאים סרטניים stably transfected עם לוציפראז, אז יכול להיות חשופים הריאות perfused כדי IVIS הדמיה לאחר חיסון תוך ורידי של תאים סרטניים על תנאי רכוש 46,luciferin58,59. לחלופין, הריאות perfused יכול להיות קצוץ לחתיכות ונחשפו עיכול אנזימטי עם פרוטאזות, למשל, collagenase, שחרור תאים בודדים לתוך ההשעיה60,61. הגידול תאים עם צבעי זריחה או stably transfected עם פלורסצנטיות חלבונים ואז ניתן לכמת עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS)-ניתוח-56,-62.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות מינג-מין ד ר צ'אנג וצ'אנג יה-חסין גב' לתמיכה טכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע והטכנולוגיה של טייוואן (לרוב-103-2325-B-006-009, רוב-104-2325-B-006-001, רוב-105-2325-B-006-001, MOST-106-2320-B-006-068-MY3) משרד הבריאות ואת הרווחה (MOHW106-TDU-B-211-144004). אנחנו גם תודה על התמיכה של המעבדה לחקר הליבה של המכללה לרפואה, האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג, מיקרוסקופ קונפוקלי שלהם פוטון מרובה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
