Summary
En dyremodell er nødvendig å dechiffrere rollen som sirkulerer kreftceller (CTCs) å fremme lunge kolonisering under kreft metastasering. Her vi etablert og gjennomført en i vivo analysen spesielt prøve kravet til polymere fibronectin (polyFN) montering på CTCs for lunge kolonisering.
Abstract
Metastasering er den viktigste årsaken til død. Rollen av sirkulerende kreftceller (CTCs) å fremme kreft metastasering, der lunge kolonisering av CTCs kritisk bidrar til tidlig lunge metastatisk prosesser, har blitt kraftig undersøkt. Som sådan, er dyr modeller den eneste tilnærmingen som dekker full systemisk prosessen med metastasering. Gitt at det oppstår problemer i forrige eksperimentell design for å undersøke bidrag av CTCs til blod fartøy bloduttredelse, vi etablert i vivo lunge kolonisering analysen der en lang-sikt-fluorescens celle-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), ble brukt til å merke suspendert kreftceller og lunge perfusjon ble utført for å fjerne nonspecifically fanget CTCs før lunge fjerning, AC confocal imaging og kvantifisering. Polymere fibronectin (polyFN) sammen på CTC flater har blitt funnet for å megle lunge kolonisering i siste etableringen av metastatisk tumor vev. Her, spesielt test kravet til polyFN montering på CTCs for lunge kolonisering og bloduttredelse ved vi spilte kort sikt lunge kolonisering analyser der suspendert Lewis lunge karsinom celler (LLCs) stabilt uttrykke FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) og forhåndsinnstilte merket med 20 μM av CFSE ble intravenøst inokulert i C57BL/6 mus. Vi vist at evnene av shFN LLC celler å colonize musen lungene ble betydelig redusert i forhold til shScr LLC celler. Derfor kan denne kortsiktige metodikken bli mye brukt å spesielt demonstrere evnen til CTCs i sirkulasjon å kolonisere lungene.
Introduction
Metastasering er den viktigste årsaken til kreft dødsfall1,2. Kreftceller avledet fra primære vev angi sirkulasjonen i suspensjon og overleve ulike hematogenous utfordringer, f.eks, anoikis, immun angrep og skader på grunn av skjæring stress fra blodtrykk eller geometriske begrensninger, før de stand til å kolonisere fjerne organer, et viktig skritt dikterer suksessen metastasering3,4,5,6. Derfor, energisk tiltak for øyeblikket er gjort i karakterisere sirkulerende kreftceller (CTCs) og samkjøre disse egenskapene med svulst kreft metastasering og overlevelse kreft pasienter7,8 , 9. siden prosessen med kreft metastasering viser spesielt i vivo hendelse, dyremodeller er den eneste tilnærmingen som dekker full systemisk prosessen metastasering10,11,12 .
CTCs bli metastatisk tumor vev gjennom flere mobilnettet arrangementer, inkludert koloniseringen av fjerne organer1,2. De vanligste metastasering analyser13,14,15 gir imidlertid ikke en måte å observere CTC kolonisering av fjerne organer. Derfor er en i vivo analysen design for CTC kolonisering visualisering haster. Selv om flere i vivo og ex vivo kort fortsatt sikt lunge kolonisering analyser er utformet, problemer og ulemper. For eksempel, mens grønne fluorescens protein (GFP)-overexpressing svulst cellene har blitt brukt i disse søk22,23, det tar tid å stabilt transfect og klone kreftceller med tilstrekkelig GFP fluorescerende intensitet under mikroskopet. Tilsvarende selv om forbigående farging av kreftceller langsiktig celle Tracer CFSE har vært ansatt erstatte kreftceller uttrykk for GFP, det er vanskelig å bedømme om CFSE-merket kreftceller knyttes eller bare stede i den blodkar forbrukeravgift fjerne organer16,17.
Polymere fibronectin (polyFN) sammen på overflater av CTCs har blitt funnet å kritisk bidra til siste etableringen av metastatisk tumor vev18,19,20,21,22 . Her utført vi kort sikt lunge kolonisering analyser i hvilke suspendert Lewis lunge karsinom celler (LLCs) stabilt uttrykke FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) og pre merket med CFSE ble intravenøst inokulert i C57BL/6 mus. Etter 2-3 dager, ble musen lungene først parfyme med fosfat bufret saltvann (PBS) fjerne ledige CTCs innen er blodkar før blir utsatt AC confocal mikroskopi og kvantifisering av lunge-kolonisere LLCs. Vi tydelig viste at antall lunge-kolonisere shFN LLCs og svulst knuter ble betydelig redusert med shScr LLCs, vesentlig bekrefter rollen polyFN montering på CTCs å tilrettelegge kolonisering og vekst av CTCs i den lungene. Vår studie garanterer videre undersøkelser for rollen av polyFN i kreft metastasering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter på mus ble utført i henhold til retningslinjene for våre institute (Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, NCKU Medical College).
1. forberedelse av instrumenter og kultur medier retter
- Før du starter eksperimentelle protokollene, få sterilt kirurgisk bildet, 1 mL sprøyter med 26G/0,5 cm strikkes (for hale blodåre injeksjon), 3 mL sprøyter med 24G/3 cm strikkes (for lunge perfusjon), Dulbeccos endret Eagle Media (DMEM), trypsin-EDTA løsning (5 Finans trypsin og 0,53 mM) fetal bovin serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4og 1,8 mM KH2PO4) og 6 cm kultur retter.
2. forberedelse og gjenoppretting av kreftceller i suspensjon
- Forberede sterilt Dulbecco endret Eagle Media (DMEM) som inneholder 10% eller 20% FBS og ferske legger 2 mM L-glutamin, 1 x PBS, og utgjør 0,05% Trypsin-EDTA.
- Kultur cellene i DMEM med 10% FBS på 37 ° C og vokse dem til det er 70-80% samløpet i kultur parabolen.
- Fjern kultur media (DMEM) fra retter, etterfulgt av to vasker med 2 mL steril 1 x PBS.
- Legge 1 mL av 0,05% Trypsin-EDTA i rettene grundig dekke alle cellene. Umiddelbart fjerne 800 μL løsning og la bare 200 μL i retter. Inkuber retter på 37 ° C for 30 s 1 min (avhengig av celle type) og vent til fleste cellene er deaktivert.
- Legge 1 mL av fersk DMEM som inneholder 10% FBS direkte i retter å stoppe den enzymatiske aktiviteten av trypsin og kraftig Pipetter celle suspensjon opp og ned med en 1000 µL pipette å forberede en enkeltcelle suspensjon.
- Overføre cellene fra retten slik 1,5 mL microcentrifuge og Nedspinning cellene ved romtemperatur 162 x g i 3 minutter.
- Sug opp nedbryting og resuspend svulst celler i 1,5 mL DMEM som inneholder 20% FBS og over-gjennomgående rotere cellene i suspensjon på 37 ° C i 2 timer.
Merk: Hvis mediet blir gult i utvinning, bytte gamle mediet med fersk medium som inneholder 20% FBS.
3. fluorescens flekker og analyse av tumorceller i suspensjon med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
- Etter celle utvinning i suspensjon, telle aktuelle levedyktig cellen tallene med Trypan blå i en Neubauer telling kammer for titrating fluorescens flekker doser og for hale vene injeksjon.
- Nedspinning cellene 162 x g ved romtemperatur for 3 min og resuspend pelleted cellene i 1 mL av sterilisert 1 x PBS, etterfulgt av romtemperatur sentrifugering 162 x g i 3 minutter.
- Resuspend pelleted cellene i 500 µL av 1 X PBS som inneholder 10% FBS og 0, 5, 10, 20 eller 40 µM CFSE for dose titrering, og Inkuber celle suspensjon på 37 oC i 10 min i mørket.
- Nedspinning cellene 162 x g ved romtemperatur for 3 min og resuspend pelleted cellene med 4 mL av DMEM med 1% FBS. Gjenta dette trinnet for vask tre ganger. Resuspend pelleted cellene med 4 mL DMEM alene for siste vask.
- Underlagt CFSE-merket cellene til fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) analyse for å kvantifisere fluorescens intensiteten av en enkelt celle, eller hale blodåre injeksjon.
Merk: Holde cellene i isen før du utfører FACS analyse eller hale blodåre injeksjoner.
4. lunge kolonisering analysen
- Forberede cellene merket med 20 µM CFSE (se trinn 3.1 gjennom 3.4).
Merk: Avgjøre arbeide dosen av CFSE for merking kreftceller, basert på titrering resultatene fra FACS analyse (se trinn 3.3). - Varme opp haler av 4-6-uke-gamle mannlige C57BL/6 mus (6 mus) med metallhalid lampe i 5-10 min mus-av-mus for å dilate musen halen årer.
- Grundig blande og Sug opp CFSE-merket tumorceller med en 1 mL (26Gx1/2) sprøyte, unngå bobler i cellen suspensjon (med en siste celle tetthet 5 x 106 celler/ml).
- Nøye injisere 1 x106 CFSE-merket kreftceller i 200 µL av DMEM i musen halen venen, som bør være fast i en mus restrainer.
Merk: Under injeksjon, hvis nålen plasseres direkte i lumen i halen venen, kreftceller skal lett leveres i sirkulasjonen uten å presse hardt på sprøyten. Hvis det er vanskelig å presse kreftceller gjennom, er de mest sannsynlig blitt injisert utenfor hale venen, inn i subcutaneous plass. - Dele musene som intravenøst mottatt CFSE-merket kreftceller i to grupper: en gruppe vil gjennomgå lunge perfusjon etterfulgt av AC confocal mikroskopi og ImageJ kvantifisering i lunge kolonisering analysen og den andre vil stå alene for 4-5 uker i langsiktige lunge koloniseringen analysen.
- På 20, 38 eller 45 h og med 1 x 106 kreftceller intravenøst injisert under en tid kurs - og doseavhengig titrering, bedøve svulst rentebærende mus med 50-75 mg/kg zoletil 50, som er en godt akseptert og riktig anesthetizer23.
Merk: Bruk vet salve på muss øyne å hindre tørrhet under anestesi. - Langs skjære i hud og subkutant vev fra magen til brystet regionen med kirurgisk saks. Åpne pleural hulrommet med kirurgisk saks og tang å fullt avsløre hjertet og lungene.
Merk: Pass på å unngå å kutte av blod fartøy. - Knytte overlegen vena cava (SVC) og mindreverdig vena cava (IVC) med sterilt kirurgisk suturer å hindre tilbakestrømning av perfusjon løsning under lunge perfusjon.
- Klippe venstre ventrikkel vegg med kirurgisk saks til å åpne en sprekk (ca 2-4 mm) å drenere perfusjon løsningen fra lungene.
- Sette inn 1 x PBS i høyre ventrikkel med en 3 mL sprøyte og fjerne drenert løsningen med konstant sugekraft under lunge perfusjon til lungene slå fra en rødaktig farge til helt blek.
5. AC confocal mikroskopiske bildebehandling og analyse av lunge-kolonisert kreftceller
- Fjern nå-blek lungene fra pleural hulrom og skille fem lobes av skjære bort trachea og bindevev leddbånd med kirurgisk saks og tang24.
- Forberede en båre som lunge holder som vist i figur 3B ved svingete en nylon Sutur rundt to metallstenger å produsere en reticulate struktur med et mellomrom mellom to stenger for plassering av lunge lobes. Angi lunge abonnenten i 6 cm parabol.
Merk: Innehaveren av lunge brukes å stabilisere lunge lobes under målet linsen av AC confocal mikroskop. - Lodge og fastsette lunge lobes på reticulate tekstur av lunge holderen. Dekk og fukte lunge lobes med 1 x PBS.
- Emne 6 cm kultur parabol skjuler lunge lobes på lunge abonnenten til AC confocal mikroskopi å ta fluorescens bilder opptak kreftceller lunge-kolonisering.
- Bildebehandling, bruke målet linser (5 X, MPLN, NA: 0,1, WD: 20, Air).
- Rotere hjulet for filteret å NIBA (eksitasjon/utslipp, 470-495 nm/510-550 nm) og bruke en 488 nm laser for å opphisse CFSE, tydelig visualisere bilder av fluorescens prikker i lunge lobes.
- Rotere hjulet for filteret å R690 (for MaiTai HP DeepSee laser) for å skanne med 2.0 µs/bildepunkt skanning fart og optimalisere HV, gevinst, og forskyvningen nivåer.
- Ta fluorescens bilder (512 x 512 piksler) ved hjelp av mikroskop programvaren med en 10 µs/bildepunkt skannehastighet.
- Kvantifisere og statistisk analysere mikroskopiske bilder bruker ImageJ og GraphPad som tidligere beskrevet21.
6. langsiktig lunge kolonisering analyser
Merk: Gjenta 4.1 gjennom 4.5.
- Ofre mus etter svulst celle inoculation for 4-5 uker og fastsette deres lungen med Bouins væske25 for 1 til 2 dager.
- Kvantifisere og statistisk analysere svulst knuter fra mus lungene med programvare21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Før du utfører i vivo lunge kolonisering analysen som vist i figur 1A å teste om polyFN på suspendert kreftceller formidler lunge kolonisering og/eller bloduttredelse å tilrettelegge metastasering, titreres vi først forskjellige konsentrasjoner av CFSE, et fluorescerende stoff som cellen permeable covalently conjugates intracellulær Amin inneholder molekyler26,27 i suspendert kreftceller og forblir i cellene i ganske lang tid. Vi fant at svulsten celler ble effektivt merket med CFSE i en doseavhengig måte, som illustrert i figur 1B. CFSE-merkingen i 6 x105 LLC celler/mL nesten nådd et platå på 20 µM som illustrert i figur 1 c.
På grunn av rikelig smalere kapillær systemet som kan fysisk hindrer flyten av CTCs i lunge blodkar, utført vi lunge perfusjon i mus bærer injiseres intravenøst CFSE-merket LLC celler for å fjerne nonspecifically fanget CTCs, som illustrert i figur 1A før lunge fjerning på hvert tidspunkt som vist i Figur 4. Før perfusjonsmåling, lungene var tydelig rødlig av blod, som vist i den venstre panel på figur 2. Lungene ble blek etter perfusjon med 10-15 mL av 1 x PBS, som vist i det høyre panelet på figur 2.
Straks perfused musen lungene ble fjernet fra pleural plass, ble lunge lobes skilt og montert på lunge abonnenten plassert i retter som vist i figur 3A med 1 x PBS grundig dekker lungene lobes. Lunge lobes montert på lunge holderen som vist i figur 3B ble utsatt for AC confocal fluorescens mikroskopi som vist i figur 3A. CFSE-merket kreftceller kolonisere lungene ble avbildet som vist i den øvre panel i Figur 3 c og omgjort til svart-hvitt-bilder som vist i den nedre panel av Figur 3 c å lette kvantifisering av lunge kolonisering med bilde J programvare.
Vi injiseres intravenøst enten shScr eller shFN LLC cellene som ble merket med 20 µM CFSE og ventet på en gang kurs fra 24-72 h før du utfører den lunge perfusions og AC confocal mikroskopiske bildebehandling. Kvantifisering av lunge-kolonisere svulst cellene i 6 mus som vist i figur 4A med ImageJ programvare avslørt at betydelig færre shFN LLC celler enn shScr LLC celler ble regnet på 38 h. og 45 h klokkeslett poeng, som illustrert i figur 4B . Grunnen hvorfor antall både lunge-kolonisert shScr og shFN LLC celler gradvis redusert var svært sannsynlig på grunn av kontinuerlig cytotoksisitet utøves av sirkulasjons immunitet selv mot allerede koloniserte LLC cellene. Til sammen disse resultatene tyder på at polyFN sammen på CTCs er faktisk nødvendig formidling lunge kolonisering av LLC celler, fører til fullstendig metastasering i lungene som åpenbart av resultatene i som noen mus intravenøst mottar dele det CFSE-merket shScr og shFN LLC celler for lunge kolonisering analyser som vist i Figur 4 var igjen aloneuntil lunge svulst knuter ble utviklet i eksperimentell svulst metastasering analysen som vist i figur 5A og 5B.
Figur 1: titrering for på CFSE for merking kreftceller i lunge kolonisering analysen. (A) skjematisk illustrasjon av prosedyrer for lunge kolonisering analysen og eksperimentelle metastasering analysen som beskrevet i delen protokoller. (B) FACS analyse for CFSE fluorescens intensiteter LLC celler som var farget med ulike konsentrasjoner av CFSE. (C) fluorescens intensiteter var plottet som funksjoner for ulike CFSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: lungene før og etter perfusjon. Representant bilder av lungene før (unperfused; Unperf.) og etter (perfused; Perf.) utfører lunge perfusjon. Gullstjerne: hjertet. Hvit pil: tie som lukket IVC/SVC. Røde piler: lungene til samme musen før og etter perfusjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: montering av parfyme lunge flikene på lunge holderen for fluorescens AC confocal mikroskopi. (A) ordningen med lunge-montering på lunge holderen for AC confocal mikroskopi. (B) et representativt bilde av 3 perfused lunge lobes på lunge abonnenten. (C) representant bilder av lunge-kolonisere LLC celler med CFSE fluorescens for kvantifisering av bildet J programvare. Øvre panel: vanlig imaging. Nedre panel: reversert svart-hvitt imaging. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: tid kurs bildebehandling, kvantifisering og statistisk analyse for lungene kolonisert shScr og shFN LLC cellene etter lunge perfusjon i lunge kolonisering analysen. (A) representant svart-hvitt-bilder (konvertert fra fluorescens bilder) av shScr og shFN LLC celler som ble kolonisert i lunge blodkar på ulike tidspunkt avbildet etter omfattende lunge perfusjon. Prikkete linjene betegne kanten av i fokus AC confocal lunge vev områdene. (B) kvantifisering og statistiske analyser for lunge-kolonisere LLC cellene som visualisert i (A) av gjennomsnittlig 5 absolutt representant bilder/lungekreft lobe/mus. Merk: Hver bar indikerer gjennomsnitt fluorescens intensiteten av områdene i fokus AC confocal. Data var statistisk analysert fra 6 mus og rapportert som betyr ± SD; født betyr nonsignificant; * betyr p < 0,05; og ** betyr p < 0.01; Toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: stanse FN uttrykk i CFSE-merket LLC celler reduserer svulst knuter i lungene på lang sikt i vivo CTC kolonisering analysen. (A) Bouin væske-fast musen lungene bærer svulst knuter avledet fra CFSE-merket shScr eller shFN LLC celler. (B) kvantifisering og statistiske analyser for svulst knuter i lungene. Data rapporteres som betyr ± SD; : p < 0,001; n = 6 per gruppe; Kortet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammen med lang sikt lunge kolonisering analyser, kort sikt metodikk vi ansatt her for å vurdere i vivo lunge kolonisering av CTCs i fjerne organer åpenbart avsløre og differensiert spesifikke rollen polyFN sammen på CTCs i kolonisere lungene, som deretter førte til bloduttredelse og metastatisk prosesser18,19,20,21. Selv om merking celler med langsiktige cellen bane CFSE tillatt oss å spore de intravenøst injisert CTCs for opp til tre dager før lunge perfusjon og beholde tilstrekkelig grønne fluorescens for kvantitative formål, var det umulig å avgjøre direkte om kreftceller ble plassert i fartøyet lumen eller allerede hadde extravasated fra blodkar. For å løse dette problemet, røde fluorescerende kan rhodamine-konjugerte dekstran kan nonspecifically binde til lectins uttrykt på endothelia brukes til å merke er lunge blodkar under lunge perfusjon28,29, 30. til tross for at CFSE er en langsiktig cellen bane, fluorescens intensitet er halvert hver celledeling27, begrenser potensialet av benytter den inne merking teknikker. For å omgå dette problemet, bør det være konstatere at merking dosering av CFSE er tilstrekkelig for celler forblir synlig for hele varigheten av in vivo eksperimenter og at noen behandling brukt på cellene har ingen innvirkning på celle spredning. Fordi sammenligning og måling av lunge-kolonisere shScr og shFN CTCs ble gjort i egen mus, kan det hevdes at forskjellene mellom de to gruppene var på grunn av individuell variasjon. For å utelukke slike variasjoner, kan en blanding av to typer av svulst celler merket med tydelige fluoresce fargestoffer (f.eks CFSE/CM-diI) eller stabilt transfekterte med GFP/dsRed samtidig intravenøst injiseres inn i den samme dyr i lunge koloniseringen analysen31,32,33. Det er verdt å merke seg at kloning effekter fra cellen kloning teknologi som er forsøkt å sortere ut stabilt fluorescerende protein-transfekterte cellen kloner med sterke nok fluorescens34,35, 36 , 37 kan gjøre klonet cellene representative representerer hele heterogene populasjoner38,39,40. Hvis en stabil hva noen fluorescerende protein i kreftceller ønskes for lunge kolonisering analyser, bør heve transfection effektiviteten av kreftceller som helhet bedre bevare de opprinnelige egenskapene enn kloning cellen populasjoner med tilstrekkelig fluorescens41,42.
Lunge perfusjon trinn i lunge koloniseringen analyser er nødvendig at noen intravenøst injisert kreftceller, i stedet for spesielt arrestere lunge kapillær systemet, pleier å være mekanisk fanget og fast i kapillært nettverk av lunge vev på grunn av middel større diameter på CTCs enn bredden på lunge kapillær lumen43,44. Kvantifisering av kreftceller lunge-kolonisere uten perfusing lungene kan føre til en overvurdering av feilaktig telle mekanisk fastkjørte celler45,46,47. Selv om lungene har vært parfyme, forblir flere problemer. For eksempel, er det fortsatt vanskelig å skille kreftceller lunge-kolonisere ligger på lumenal endothelia eller har allerede extravasated fra blodkar. Du løser dette problemet, farging blodkar med Rhodamine-konjugerte dekstran som nevnte kan være nyttig30,48,49. Alternativt, hvis kvantifisering av svulst bloduttredelse, kalsium-chelator EDTA/EGTA eller trypsin, en uspesifisert protease, kan brukes i perfusjon bufferen for å hindre kalsium-avhengige og -uavhengige svulst celle vedheft hendelser50 , 51 , 52. dermed kreftceller igjen i lunge vev kan betraktes som extravasated.
For kvantifisering av kreftceller lunge-kolonisere, er perfused lungene ofte utsatt for tradisjonelle AC confocal mikroskopi. Imidlertid begrenset Målbarhet vev dybde innpass vev autofluorescence og fluorescens spredning effekter, rendering dypere vev undetectable53,54. To Foton mikroskop med høyere følsomhet enn tradisjonelle AC confocal mikroskop er egnet til å løse slike problemer i at nær infrarød stråling brukes i to-fotonet eksitasjon med betydelig mindre absorpsjon av biologiske prøver enn UV eller blå-grønne lys gjør teknikken mer passende for imaging tykk prøver55,56,57. Lunge-kolonisere kreftceller telles ved å beregne svulst celle tall i flere representant AC confocal bilder, som ikke inkluderer hele antallet lunge-kolonisere kreftceller i hele lungene av en individuell dyr. Kreftceller stabilt transfekterte med luciferase kan brukes for å kvantifisere hele lungene i lunge kolonisering analyser, og perfused lungene kan deretter bli utsatt for IVIS imaging etter intravenøs vaksinasjon av suspendert kreftceller i nærvær av luciferin46,58,59. Alternativt kunne perfused lungene, hakket i biter og utsatt enzymatisk fordøyelsen med proteaser, f.eks, collagenase, slippe enkeltceller inn suspensjon60,61. Svulst celler med fluorescens fargestoffer eller transfekterte stabilt med fluorescens proteiner kan deretter kvantifiseres fluorescens-aktivert cellen sortering (FACS) analyse56,62.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Ming-Min Chang og Ms. Ya-Hsin Cheng deres kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av Taiwans departementet for vitenskap og teknologi (de fleste-103-2325-B-006-009, de fleste-104-2325-B-006-001, de fleste-105-2325-B-006-001 og MOST-106-2320-B-006-068-MY3) og helse og velferd (MOHW106-TDU-B-211-144004). Vi er også takknemlige for støtten fra kjernen forskningslaboratoriet av College of Medicine, National Cheng Kung University, for deres multi Foton AC confocal mikroskop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
