Summary
En djurmodell som behövs för att dechiffrera rollen av cirkulerande tumörceller (CTCs) att främja lung koloniseringen under cancer metastaser. Här vi etablerat och framgångsrikt utfört en i vivo assay specifikt prov kravet på polymera Fibronektin (polyFN) montering på CTCs för lung kolonisering.
Abstract
Metastaser är den största orsaken till dödsfall i cancer. Rollen av cirkulerande tumörceller (CTCs) att främja cancer metastaser, där lungan koloniseringen av CTCs kritiskt bidrar till tidig lungcancer metastaserande processer, har undersökts kraftigt. Som sådan, är djurmodeller den enda strategi som fångar full systemisk processen av metastaser. Med tanke på att det uppstår problem i tidigare experimentell design för att undersöka CTCs bidrag till blodkärl extravasering, vi etablerat ett koloniseringen i vivo lung test där en lång-sikt-fluorescens cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), användes att märka svävande tumörceller och lung perfusion utfördes för att rensa icke-specifikt fångade CTCs före lung borttagning, confocal imaging och kvantifiering. Polymera Fibronektin (polyFN) monteras på CTC ytor har konstaterats för att medla lung kolonisationen i det slutliga inrättandet av metastaserande tumör vävnader. Här, för att specifikt testa kravet på polyFN montering på CTCs för lung koloniseringen och extravasering, vi utfört kort sikt lung colonization analyser där svävande Lewis lung carcinom celler (LLCs) stabilt uttrycker FN-shRNA (shFN) eller Scramble-shRNA (shScr) och pre märkt med 20 μM av CFSE var intravenöst inokuleras i C57BL/6 möss. Vi har framgångsrikt visat att shFN LLC celler förmåga att kolonisera mus lungorna minskades avsevärt i jämförelse med shScr LLC celler. Därför kan denna kortsiktiga metod tillämpas allmänt för att specifikt Visa förmåga för CTCs inom cirkulationen att kolonisera lungorna.
Introduction
Metastaser är den största orsaken till cancer döden1,2. Tumörceller som härrör från primära vävnader ange cirkulationen i suspension och överleva olika hematogen utmaningar, t.ex., anoikis, immun anfallar och skadestånd på grund av shear stress från blodtryck eller geometriska begränsningar, innan de är kunna kolonisera avlägsna organ, ett viktigt steg diktera framgången av metastaser3,4,5,6. Därför har krafttag för närvarande gjorts i kännetecknar cirkulerande tumörceller (CTCs) och korrelera dessa egenskaper med tumör malignitet, metastaser och överlevnaden av cancer patienter7,8 , 9. eftersom processen för cancer metastaser skildrar specifikt en in-vivo -händelse, djurmodeller är den enda strategi som fångar processen full systemiska metastas10,11,12 .
CTCs blivit metastaserande tumör vävnader genom flera cellulära händelser inklusive koloniseringen av avlägsna organ1,2. Den vanligaste metastaser analyser13,14,15 ger dock inte ett sätt att observera CTC koloniseringen av avlägsna organ. Därför behövs omgående en i vivo test design för CTC colonization visualisering. Även om flera i vivo och ex vivo kort kvarstår sikt lung colonization analyser har utformats, problem och nackdelar. Till exempel, medan grönt fluorescerande protein (GFP)-överuttryck av tumör celler har använts i dessa analyser22,23, det tar tid att stabilt transfect och klona tumörceller med tillräckligt god Jordbrukarsed fluorescerande intensitet under mikroskopet. På samma sätt även om övergående färgning av tumörcellerna med den långsiktiga cell tracer CFSE har använts för att ersätta tumörcellerna GFP-uttryckande, det fortfarande svårt att bedöma huruvida CFSE-märkt tumörcellerna är kopplade eller bara finns inom den vaskulatur av exciderad avlägsna organ16,17.
Polymera Fibronektin (polyFN) monteras på ytor av CTCs har befunnits kritiskt bidra till det slutliga inrättandet av metastaserande tumör vävnader18,19,20,21,22 . Här, utfört vi kort sikt lung colonization analyser där svävande Lewis lung carcinom celler (LLCs) stabilt uttrycker FN-shRNA (shFN) eller scramble-shRNA (shScr) och pre märkt med CFSE var intravenöst inokuleras i C57BL/6 möss. Efter 2-3 dagar, var mus lungorna först perfusion med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) att helt ta bort lös CTCs inom vaskulatur innan utsätts konfokalmikroskopi och kvantifiering av lung-kolonisera LLCs. Vi visade tydligt att de antal lung-kolonisera shFN LLCs och tumör knölar minskade betydligt jämfört med shScr LLCs, väsentligen bekräftar polyFN montering på CTCs roll i att underlätta kolonisation och tillväxten av CTCs i den lungorna. Vår studie motiverar ytterligare utredning för rollen av polyFN i cancer metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment på möss utfördes enligt riktlinjerna för vår institute (Handbok för skötsel och användning av försöksdjur, NCKU Medical College).
1. beredning av instrument, kultur Media och rätter
- Innan du börjar de experimentella protokoll, få sterila kirurgiska suturer, 1 mL sprutor med 26G/0,5 cm nål (för svans ven injektion), 3 mL sprutor med 24G 3 cm nål (för lung perfusion), Dulbeccos modifierade Eagle Media (DMEM), trypsin-EDTA-lösning (5 Redov trypsin och 0,53 mM), fetalt bovint serum (FBS), 1 x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PHO4och 1,8 mM KH2PO4) och 6 cm kultur rätter.
2. förberedelser och återställning av tumörceller i Suspension
- Förbereda sterila Dulbeccos modifierade Eagle Media (DMEM) innehållande 10% eller 20% FBS och nymalen lägga till 2 mM L-glutamin, 1 x PBS och 0,05% Trypsin-EDTA.
- Odla cellerna i DMEM kompletteras med 10% FBS vid 37 ° C och odla dem tills det är 70-80% sammanflödet i kultur skålen.
- Kultur media (DMEM) ta bort de rätter, följt av två tvättar med 2 mL steril 1 x PBS.
- Tillsätt 1 mL 0,05% Trypsin-EDTA i rätterna att grundligt täcka alla celler. Omedelbart ta bort 800 μL av lösning och lämna bara 200 μL i maträtter. Inkubera rätter vid 37 ° C i 30 s till 1 min (beroende på celltyp) och vänta tills flesta celler är i pausat tillstånd.
- Tillsätt 1 mL färsk DMEM innehållande 10% FBS direkt i rätterna att stoppa den enzymatiska aktiviteten av trypsin och kraftfullt Pipettera cellsuspensionen upp och ner med en 1000 µL pipett att förbereda en enda cellsuspension.
- Överföra cellerna från skålen till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör och snurra ner cellerna vid rumstemperatur vid 162 x g i 3 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera tumören celler i 1,5 mL DMEM som innehåller 20% FBS och över slut rotera celler i suspension vid 37 ° C i 2 h.
Obs: Om mediet blir gult under återvinning, utbyta det gamla mediet med färska medium innehållande 20% FBS.
3. fluorescens färgning och analys av tumörceller i Suspension med Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE)
- När cellen återhämtning i suspension, räkna de lämpliga livskraftig cell nummer med Trypan blå i en Neubauer räknar kammare för titreringen fluorescensen färgning doser för svans ven injektion.
- Snurra ner cellerna vid 162 x g i rumstemperatur i 3 min och resuspendera pelleterat cellerna i 1 mL steriliserat 1 x PBS, följt av rumstemperatur centrifugering vid 162 x g i 3 min.
- Resuspendera pelleterat cellerna i 500 µL 1 X PBS som innehåller 10% FBS och 0, 5, 10, 20 eller 40 µM CFSE för dostitrering, och inkubera cellsuspension på 37 oC i 10 min i mörker.
- Snurra ner cellerna vid 162 x g i rumstemperatur i 3 min och resuspendera pelleterat cellerna med 4 mL DMEM innehållande 1% FBS. Upprepa detta tvätt steg tre gånger. Att resuspendera pelleterat cellerna med 4 mL DMEM enbart för den sista tvättningen.
- Ämne CFSE-märkt cellerna till fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) analys för att kvantifiera fluorescensintensiteten hos en enda cell, eller svans ven injektion.
Obs: Hålla cellerna på is innan du utför FACS analys eller svans ven injektionerna.
4. lung Colonization Assay
- Förbereda cellerna märkt med 20 µM CFSE (se steg 3.1 genom 3.4).
Obs: Bestämma den arbetande dosen av CFSE för märkning tumörceller, baserat på titrering resultaten från FACS analysen (se steg 3.3). - Värm upp svansen på 4-6 vecka-gamla manliga C57BL/6 möss (6 möss) med en metallhalidlampor lampa för 5-10 min på mus-av-mouse basis att vidga mus svans vener.
- Grundligt blanda och aspirera CFSE-märkt tumörceller med en spruta med 1 mL (26Gx1/2), undvika eventuella bubblor i cellsuspensionen (med en sista cell densiteten på 5 x 106 celler/mL).
- Injicera försiktigt 1 x106 CFSE-märkt tumörceller i 200 µL DMEM i mus svans ven, som bör ställas i en mus fasthållning.
Obs: Under injektionen om nålen placeras direkt i lumen av svans ven, tumörceller bör enkelt levereras i cirkulationen utan att behöva trycka hårt på sprutan. Om det är svårt att driva tumörcellerna genom, har de sannolikt varit injiceras utanför svans venen, subkutan utrymmet. - Dela upp de möss som fick intravenöst CFSE-märkt tumörcellerna i två grupper: en grupp kommer att genomgå lung perfusion följt av konfokalmikroskopi och ImageJ kvantifiering i lungan colonization analysen och den andra kommer att lämnas ensam för 4-5 veckor lång sikt lung koloniseringen assay.
- Vid 20, 38 eller 45 h och med 1 x 106 tumörceller injiceras intravenöst under en tid kurs - och dosberoende titrering, söva tumör-bärande möss med 50-75 mg/kg zoletil 50, som är en väl accepterade och riktigt anesthetizer23.
Obs: Använd vet salva på mösss ögon att förhindra torrhet under anestesi. - Längdriktningen skär hud och subkutan vävnad från buken i bröstet regionen med kirurgisk sax. Öppna Plura med kirurgisk sax och pincett att helt avslöja hjärta och lungor.
Obs: Var noga med att undvika skära av blodkärl. - Knyt den överlägsna vena cava (SVC) och sämre vena cava (IVC) med sterila kirurgiska suturer för att förhindra återflödet av perfusion lösning under lungan perfusion.
- Skär vänster kammare väggen med kirurgisk sax för att öppna en spricka (ca 2-4 mm) för att tömma perfusion lösningen från lungorna.
- Injicera 1 x PBS i höger kammare med en 3 mL-sprutan och ta bort den avrunna lösningen med konstant sug under lungan perfusion tills lungorna vända från en rödaktig färg till helt blek.
5. confocal mikroskopbilder och analys av Lung-koloniserade tumörceller
- Ta bort nu-blek lungorna från pleural hålighet och separata fem loberna genom att skära bort de luftstrupe och bindväv ligament med kirurgisk sax och pincett24.
- Förbereda en bår-liknande lung hållare som visas i figur 3B av slingrande en nylon sutur runt två metallstänger att producera en nätaktigt textur med ett blanksteg mellan två stavar för placering av lung lober. Som innehavaren av lungcancer i en 6 cm maträtt.
Obs: Lung innehavaren kommer att användas för att stabilisera lungan loberna under objektivet av en confocal Mikroskop. - Inge och fixa lungan loberna på nätaktigt konsistens av innehavaren av lungan. Täcka och Fukta de lung loberna med 1 x PBS.
- Ämne 6 cm kultur skålen härbärgerat lungan loberna på lung innehavaren att konfokalmikroskopi bildtagning fluorescens inspelning tumörcellerna lung-kolonisera.
- För imaging, använda objektiv (5 X, MPLN, NA: 0.1, WD: 20, luft).
- Rotera hjulet för filtret att NIBA (excitation/utsläpp; 470-495 nm/510-550 nm) och använda en 488 nm laser för att upphetsa CFSE, att tydligt visualisera bilder av fluorescens prickar i lungan loberna.
- Rotera hjulet för filtret att R690 (för MaiTai HP DeepSee laser) skanna med 2.0 µs/pixel scanning hastighet och optimera den HV, Gain och offset nivåer.
- Bildtagning fluorescens (512 x 512 pixlar) med hjälp av mikroskopet programvaran med en 10 µs/pixel avsökningen fart.
- Kvantifiera och statistiskt analysera mikroskopiska bilderna med ImageJ och GraphPad software som tidigare beskrivits21.
6. lång sikt lung colonization analyser
Anm: Upprepa steg 4.1 genom 4.5.
- Offra möss efter tumör cell inympning för 4-5 veckor och fixa sina lungor med Bouins vätska25 för 1 till 2 dagar.
- Kvantifiera och statistiskt analysera de tumör knölar från möss lungorna med programvara21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innan du kan utföra i vivo lung colonization analysen som illustreras i figur 1A att testa om polyFN på svävande tumörceller förmedlar lung koloniseringen och/eller extravasering att underlätta metastaser, titreras vi först olika koncentrationer av CFSE, en fluorescerande förening som är cellen genomsläpplig och kovalent konjugat intracellulära amine-innehållande molekyler26,27 i svävande tumörceller och förblir i cellerna under ganska lång tid. Vi hittade denna tumör celler var effektivt märkt med CFSE på ett dosberoende sätt, som illustreras i figur 1B. CFSE-märkning i 6 x105 LLC celler/mL nästan nått en platå på 20 µM som illustreras i figur 1 c.
På grund av riklig förträngda kapillär systemet som kan fysiskt hindra flödet av CTCs inom den lungorna kärlsystemet, utfört vi lungceller perfusion hos möss med intravenöst injicerat CFSE-märkt LLC för att rensa icke-specifikt fångade CTCs, som illustreras i figur 1A innan lung bort vid varje tidpunkt som avbildas i figur 4. Innan perfusion, lungorna var tydligt rödaktig på grund av förekomst av blod, som illustreras i den vänstra panelen i figur 2. Lungorna blev blek efter perfusion med 10-15 mL av 1 x PBS, som illustreras i den högra panelen av figur 2.
Omedelbart efter perfunderade mus lungorna togs bort från pleura rymden, lungan loberna skildes och monterade på hållaren lung placeras i rätter som illustreras i figur 3A med 1 x PBS noggrant täcker lungan loberna. Lungan loberna monterade på hållaren för lungcancer som illustreras i figur 3B utsattes för confocal fluorescensmikroskopi som illustreras i figur 3A. CFSE-märkt tumörcellerna kolonisera lungorna var avbildad som illustreras i den övre panelen av figur 3 c och förvandlas till svartvita bilder som illustreras i den nedre panel av figur 3 c att underlätta kvantifiering av lung kolonisering med bild J programvara.
Vi injiceras intravenöst antingen shScr eller shFN LLC-celler som var märkt med 20 µM CFSE och väntade på en dags kurs från 24-72 h innan du utför de lung perfusioner och confocal mikroskopbilder. Kvantifiering av lung-kolonisera tumören celler i 6 möss som illustreras i figur 4A med ImageJ programvara avslöjade betydligt färre shFN LLC celler än shScr LLC celler att räknades vid 38 h och 45 h tidpunkter, som illustreras i figur 4B . Anledningen till att antalet både lung-koloniserade shScr och shFN LLC celler gradvis minskat var mycket troligt på grund av Kontinuerlig cytotoxiciteten utövas av cirkulationens immunitet även mot redan koloniserade LLC cellerna. Sammantaget tyder dessa resultat på att polyFN monterade på CTCs krävs faktiskt i medla lung koloniseringen av LLC celler, vilket leder till komplett metastaser i lungorna som avslöjades av resultaten i vilken vissa möss intravenöst emot alikvoter av den CFSE-märkt shScr och shFN LLC celler för lung colonization analyserna som illustreras i figur 4 lämnades aloneuntil lung tumör knölar utvecklades i experimentell tumör metastasering analysen som illustreras i figur 5A och 5B.
Figur 1: titrering av CFSE koncentrationer för märkning tumörceller i lungan colonization analysen. (A) Schematisk illustration av förfaranden för lung colonization analysen och experimentella metastaser analysen som beskrivs i avsnittet protokoll. (B) FACS analys för CFSE fluorescens stödnivåerna LLC celler som var målat med olika koncentrationer av CFSE. (C) fluorescens stödnivåer var ritade som funktioner av olika CFSE koncentrationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lungorna före och efter perfusion. Representativa bilder av lungorna före (unperfused; Unperf.) och efter (perfusion; Perf.) utför lung perfusion. Guldstjärna: hjärtat. Vit pil: slipsen som stängde den IVC/SVC. Röda pilar: lungorna av samma mus före och efter perfusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: montering av den perfunderade lung loberna på hållaren lung för fluorescens konfokalmikroskopi. (A) systemet för lung-montering på hållaren lung för konfokalmikroskopi. (B) en representativ bild av 3 perfunderade lung lober på hållaren för lungcancer. (C) representativa bilder av lung-kolonisera LLC celler med CFSE fluorescens för kvantifiering av bild J software. Övre panelen: regelbunden imaging. Nedre panelen: omvänd svartvita imaging. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: tid kursen imaging, kvantifiering och statistisk analys för lungan koloniserade shScr och shFN LLC celler efter lung perfusion i lungan colonization analysen. (A) representativa svartvita bilder (konverterade från fluorescens bilder) av shScr och shFN LLC-celler som var koloniserade i den lung vaskulatur vid olika tidpunkter som skildras efter omfattande lung perfusion. Streckade linjer anger kanten av områdena i fokus confocal lunga vävnad. (B) kvantifiering och statistisk analys av lung-kolonisera LLC celler som visualiseras i (A) av genomsnitt 5 absolut representativa bilder/lung LOB/mus. Obs: Varje stapel indikerar i genomsnitt fluorescensintensiteten hos varje i-fokus confocal område. Data var statistiskt analyserats från 6 möss och rapporterats som genomsnitt ± SD; n.s. innebär signifikanta; * betyder p < 0,05; och ** betyder p < 0,01; Tvåvägs ANOVA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tysta FN uttryck i CFSE-märkt LLC celler minskar tumör noduli i lungorna på lång sikt i vivo CTC colonization assay. (A) Bouin vätska-fast musen lungorna med tumör knölar härrör från CFSE-märkt shScr eller shFN LLC celler. (B) kvantifiering och statistisk analys för de tumör knölar i lungorna. Data rapporteras som genomsnitt ± SD; : p < 0,001; n = 6 per grupp; Oparat t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillsammans med lång sikt lung colonization analyser, på kort sikt metodik vi anställd här för att utvärdera i vivo lung koloniseringen av CTCs i avlägsna organ tydligt Avtäcka och differentierade polyFN monteras på CTCs kolonisera specifika roll lungorna, som sedan ledde till extravasering och metastaserande processer18,19,20,21. Även om märkning celler med lång sikt cell tracker CFSE tillät oss att spåra de intravenöst injicerad CTCs för upp till tre dagar före lung perfusionen och behålla tillräckligt grön fluorescens för kvantitativa syften, var det omöjligt att direkt fastställa om tumörcellerna var belägna inom fartyget lumen eller hade redan extravasering från blodkärlen. För att lösa detta problem, röd fluorescerande kan rodamin-konjugerad dextran som förmår icke-specifikt binder till lektiner uttryckt på endothelia användas att märka de lung vaskulatur under lungan perfusion28,29, 30. Trots det faktum att CFSE är en långsiktig cell tracker, dess fluorescensintensitet är halveras varje celldelning27, begränsa möjligheten att använda det i märkning tekniker. För att kringgå detta problem, bör det utrönas att märkning doseringen av CFSE räcker för celler att förblir detekterbar för hela löptid i vivo experiment och att någon behandling tillämpas på cellerna har ingen effekt på cellen spridning. Eftersom jämförelsen och kvantifiering av lung-kolonisera shScr och shFN CTCs var gjort i separata möss, kan det hävdas att skillnaderna mellan de två grupperna var på grund av individuella variationen. För att utesluta sådan variation, injiceras en blandning av två typer av tumör celler märkta med distinkta fluorescerar färgämnen (t.ex. CFSE/CM-diI) eller stabilt transfekterade med GFP/dsRed concomitantly intravenöst i samma djur i lungan koloniseringen assay31,32,33. Det är värt att notera att kloning effekter till följd av cellen kloning teknik som är försökte sortera stabilt fluorescerande protein-transfekterade cell kloner med tillräckligt stark fluorescens34,35, 36 , 37 kan göra med klonade celler representativitet att representera hela heterogena populationer38,39,40. Om en stabil transfection av någon fluorescerande protein i tumörceller önskas för lung colonization analyserna, bör upphöja transfection effektiviteten av tumörcellerna som helhet bättre bevara de ursprungliga egenskaperna än kloning cellen populationer med tillräcklig fluorescens41,42.
Lungan perfusionen steg i lungan koloniseringen analyser är nödvändiga att vissa intravenöst injicerad tumörceller, i stället för specifikt arrestera till lung kapillär systemet, tenderar att vara mekaniskt instängd och fastnat inom de kapillära nätverk av lunga vävnaderna på grund av de Genomsnittligt större diametrarna av CTCs än bredden på lung kapillär lumen43,44. Kvantifiering av tumörcellerna lung-kolonisera utan startas lungorna kan leda till en överskattning av felaktigt räknar den mekaniskt fastnat celler45,46,47. Även om lungorna har varit perfusion, kvar ytterligare problem. Exempelvis är det fortfarande svårt att skilja om tumörcellerna lung-kolonisera ligger på de lumenal endothelia eller har redan extravasering från blodkärlen. Lös problemet genom färgning blodkärlen med rodamin-konjugerad dextran som ovannämnda kan vara användbar30,48,49. Alternativt, om kvantifiering av tumör extravasering önskas, kalcium-kelator EDTA/EGTA eller trypsin, en icke-specifik proteas, kan användas i perfusion bufferten för att hindra kalcium-beroende och -oberoende tumör cell adhesion händelser50 , 51 , 52. således tumörcellerna kvar i lungan vävnader kan anses som extravasering.
För kvantifiering av tumörcellerna lung-kolonisera utsätts perfunderade lungorna ofta för traditionella konfokalmikroskopi. Measurabilityen av vävnad djup begränsas dock beror delvis på vävnad autofluorescens och fluorescens spridning effekter, rendering djupare vävnader omätbara53,54. Två foton Mikroskop med högre känslighet än traditionella confocal Mikroskop är lämplig för att lösa sådana problem i att nära-infraröd strålning används i två-photon excitation med betydligt mindre absorption av biologiska prover än UV eller blå-gröna ljus gör tekniken mer lämpligt för imaging tjocka exemplar55,56,57. Lung-kolonisera tumörceller räknas av genomsnitt tumör cell nummer i flera representativa confocal bilder, vilka inte omfattar hela antalet lung-kolonisera tumörceller i hela lungorna av ett enskilt djur. För att kvantifiera hela lungorna i lungan colonization analyserna, tumörceller transfekterade stabilt med luciferas kunde anställas och perfunderade lungorna kan då utsättas för IVIS imaging efter intravenös inympning av suspenderade tumörceller i närvaro av Luciferin46,58,59. Alternativt kunde perfunderade lungorna vara hackad i bitar och utsätts för enzymatisk nedbrytning med proteaser, t.ex., kollagenas, släppa enstaka celler i suspension60,61. Tumören celler med fluorescens färgämnen eller transfekterade stabilt med fluorescens proteiner kunde då kvantifieras med fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) analys56,62.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr Ming-Min Chang och Ms. Ya-Hsin Cheng för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av Taiwans ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta-103-2325-B-006-009, de flesta-104-2325-B-006-001, de flesta-105-2325-B-006-001 och MOST-106-2320-B-006-068-MY3) och ministeriet för hälsa och välfärd (MOHW106-TDU-B-211-144004). Vi är också tacksamma för stödet från Core forskningslaboratorium för College of Medicine, National Cheng Kung University, för deras flera photon confocal mikroskopet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-9048-46-8 | |
| Bouin's Fluid | MCC(medical chemical corporation)/POISON | 456-A-1GL | |
| CFSE Proliferation Dye | ebiosciences | 65-0850-85 | Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester |
| Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 12100-061 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-6381-92-6 | For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) |
| Fetal bovine serum (FBS) | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 10437-028 | |
| Lewis lung carcinoma (LLC) | ATCC, Manassas, VA, USA | CRL-1642 | |
| L-Glutamine, USP | (Gibco)ThermoFisher Scientific | 21051-024 | |
| Potassium chloride (KCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7447-40-7 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM ) |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7778-77-0 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM ) |
| Sodium chloride (NaCl) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-7647-14-5 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM ) |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) | 101-10039-32-4 | For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM ) |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T6146 | 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T4799 | For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L ) |
| Zoletil 50 | Virbac | To dilute with 1X PBS | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Compact Tabletop Centrifuge 2420 | KUBOTA Co. | 2420 | |
| Culture dish (6cm) | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 705001 | |
| Disposable syringe (with needle) | Perfect Medical Industry Co. | 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml | |
| End over end mixer | C.T.I YOUNG CHENN | TS-20 | For suspended cells recovery |
| FACSCalibur (FACS) | BD biosciences | ||
| Forceps | Dimeda | 10.102.14 | |
| Forma Direct Heat CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc. | HEPA CLASS 100 | |
| Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) | Stoelting | 51338 | |
| Multiphoton Confocal Microscope BX61WI | Olympus | FV1000MPE | |
| Neubauer counting chamber | Marienfeld-Superior | 640010 | |
| Surgical scissor | Dimeda | 08.370.11 | |
| Surgical sutures | UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. | NO. 0034 | Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0) |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | |
| 15 mL Greiner tube | Greiner bio-one | 188271 |
References
- Massague, J., Obenauf, A. C. Metastatic colonization by circulating tumour cells. Nature. 529 (7586), 298-306 (2016).
- Lambert, A. W., Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A.
- Mohme, M., Riethdorf, S., Pantel, K. Circulating and disseminated tumour cells - mechanisms of immune surveillance and escape. Nat Rev Clin Oncol. 14 (3), 155-167 (2017).
- Steinert, G., et al. Immune escape and survival mechanisms in circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
- Mahauad-Fernandez, W. D., Okeoma, C. M. Cysteine-linked dimerization of BST-2 confers anoikis resistance to breast cancer cells by negating proapoptotic activities to promote tumor cell survival and growth. Cell Death Dis. 8 (3), e2687 (2017).
- Maheswaran, S., Haber, D. A. Circulating tumor cells: a window into cancer biology and metastasis. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 96-99 (2010).
- Yu, M., et al. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Adams, D. L., et al. Mitosis in circulating tumor cells stratifies highly aggressive breast carcinomas. Breast Cancer Res. 18 (1), 44 (2016).
- Baccelli, I., et al. Identification of a population of blood circulating tumor cells from breast cancer patients that initiates metastasis in a xenograft assay. Nat Biotechnol. 31 (6), 539-544 (2013).
- Malladi, S., et al. Metastatic Latency and Immune Evasion through Autocrine Inhibition of WNT. Cell. 165 (1), 45-60 (2016).
- Spiegel, A., et al. Neutrophils Suppress Intraluminal NK Cell-Mediated Tumor Cell Clearance and Enhance Extravasation of Disseminated Carcinoma Cells. Cancer Discov. 6 (6), 630-649 (2016).
- Pattabiraman, D. R., et al. Activation of PKA leads to mesenchymal-to-epithelial transition and loss of tumor-initiating ability. Science. 351 (6277), aad3680 (2016).
- van der Weyden, L., et al. Genome-wide in vivo screen identifies novel host regulators of metastatic colonization. Nature. 541 (7636), 233-236 (2017).
- Obenauf, A. C., et al. Therapy-induced tumour secretomes promote resistance and tumour progression. Nature. 520 (7547), 368-372 (2015).
- Genovese, G., et al. Synthetic vulnerabilities of mesenchymal subpopulations in pancreatic cancer. Nature. 542 (7641), 362-366 (2017).
- von Horsten, S., et al. Stereological quantification of carboxyfluorescein-labeled rat lung metastasis: a new method for the assessment of natural killer cell activity and tumor adhesion in vivo and in situ. J Immunol Methods. 239 (1-2), 25-34 (2000).
- Reymond, N., et al. Cdc42 promotes transendothelial migration of cancer cells through beta1 integrin. J Cell Biol. 199 (4), 653-668 (2012).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Elble, R. C., Pauli, B. U. Lung endothelial dipeptidyl peptidase IV promotes adhesion and metastasis of rat breast cancer cells via tumor cell surface-associated fibronectin. J Biol Chem. 273 (37), 24207-24215 (1998).
- Huang, L., et al. Protein kinase Cepsilon mediates polymeric fibronectin assembly on the surface of blood-borne rat breast cancer cells to promote pulmonary metastasis. J Biol Chem. 283 (12), 7616-7627 (2008).
- Chang, Y. H., et al. Secretomic analysis identifies alpha-1 antitrypsin (A1AT) as a required protein in cancer cell migration, invasion, and pericellular fibronectin assembly for facilitating lung colonization of lung adenocarcinoma cells. Mol Cell Proteomics. 11 (11), 1320-1339 (2012).
- Wang, Y. J., et al. Pterostilbene prevents AKT-ERK axis-mediated polymerization of surface fibronectin on suspended lung cancer cells independently of apoptosis and suppresses metastasis. J Hematol Oncol. 10 (1), 72 (2017).
- Cheng, H. C., Abdel-Ghany, M., Pauli, B. U. A novel consensus motif in fibronectin mediates dipeptidyl peptidase IV adhesion and metastasis. J Biol Chem. 278 (27), 24600-24607 (2003).
- Hsu, Y. Y., et al. Thrombomodulin is an ezrin-interacting protein that controls epithelial morphology and promotes collective cell migration. FASEB J. 26 (8), 3440-3452 (2012).
- Arlt, M. J., Born, W., Fuchs, B. Improved visualization of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ perfusion of lung tissue and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells. J Vis Exp. (66), e4162 (2012).
- Shi, Y., Parhar, R. S., Zou, M., Al-Mohanna, F. A., Paterson, M. C. Gene therapy of melanoma pulmonary metastasis by intramuscular injection of plasmid DNA encoding tissue inhibitor of metalloproteinases-1. Cancer Gene Ther. 9 (2), 126-132 (2002).
- Parish, C. R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
- Migone, F. F., et al. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 2294-2299 (2016).
- Itkin, T., et al. Distinct bone marrow blood vessels differentially regulate haematopoiesis. Nature. 532 (7599), 323-328 (2016).
- Jiang, M., Qin, C., Han, M. Primary breast cancer induces pulmonary vascular hyperpermeability and promotes metastasis via the VEGF-PKC pathway. Mol Carcinog. 55 (6), 1087-1095 (2016).
- Aceto, N., et al. Circulating tumor cell clusters are oligoclonal precursors of breast cancer metastasis. Cell. 158 (5), 1110-1122 (2014).
- Zheng, Y., et al. Expression of beta-globin by cancer cells promotes cell survival during blood-borne dissemination. Nat Commun. 8, 14344 (2017).
- Chen, X., et al. Retinoic acid facilitates inactivated transmissible gastroenteritis virus induction of CD8(+) T-cell migration to the porcine gut. Sci Rep. 6, 24152 (2016).
- Saranchova, I., et al. Discovery of a Metastatic Immune Escape Mechanism Initiated by the Loss of Expression of the Tumour Biomarker Interleukin-33. Sci Rep. 6, 30555 (2016).
- Ahmed, M., et al. An Osteopontin/CD44 Axis in RhoGDI2-Mediated Metastasis Suppression. Cancer Cell. 30 (3), 432-443 (2016).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death Differ. 9 (8), 786-789 (2002).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Wagenblast, E., et al. A model of breast cancer heterogeneity reveals vascular mimicry as a driver of metastasis. Nature. 520 (7547), 358-362 (2015).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Ragelle, H., et al. Chitosan nanoparticles for siRNA delivery: optimizing formulation to increase stability and efficiency. J Control Release. 176, 54-63 (2014).
- Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat Rev Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Sanchez-Laorden, B., et al. BRAF inhibitors induce metastasis in RAS mutant or inhibitor-resistant melanoma cells by reactivating MEK and ERK signaling. Sci Signal. 7 (318), ra30 (2014).
- Torchiaro, E., et al. Peritoneal and hematogenous metastases of ovarian cancer cells are both controlled by the p90RSK through a self-reinforcing cell autonomous mechanism. Oncotarget. 7 (1), 712-728 (2016).
- Wan, J., et al. Establishment of monoclonal HCC cell lines with organ site-specific tropisms. BMC Cancer. 15, 678 (2015).
- Ye, Y., Liu, S., Wu, C., Sun, Z. TGFbeta modulates inflammatory cytokines and growth factors to create premetastatic microenvironment and stimulate lung metastasis. J Mol Histol. 46 (4-5), 365-375 (2015).
- Morales, M., et al. RARRES3 suppresses breast cancer lung metastasis by regulating adhesion and differentiation. EMBO Mol Med. 6 (7), 865-881 (2014).
- Stone, J. P., et al. Mechanical removal of dendritic cell-generating non-classical monocytes via ex vivo lung perfusion. J Heart Lung Transplant. 33 (8), 864-869 (2014).
- Vettorazzi, S., et al. Glucocorticoids limit acute lung inflammation in concert with inflammatory stimuli by induction of SphK1. Nat Commun. 6, 7796 (2015).
- Urade, Y., Yoshida, R., Kitamura, H., Hayaishi, O. Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase in alveolar interstitial cells of mouse lung by bacterial lipopolysaccharide. J Biol Chem. 258 (10), 6621-6627 (1983).
- Hong, G., et al. Through-skull fluorescence imaging of the brain in a new near-infrared window. Nat Photonics. 8 (9), 723-730 (2014).
- Liu, Q., Guo, B., Rao, Z., Zhang, B., Gong, J. R. Strong two-photon-induced fluorescence from photostable, biocompatible nitrogen-doped graphene quantum dots for cellular and deep-tissue imaging. Nano Lett. 13 (6), 2436-2441 (2013).
- Peti-Peterdi, J., Burford, J. L., Hackl, M. J. The first decade of using multiphoton microscopy for high-power kidney imaging. Am J Physiol Renal Physiol. 302 (2), F227-F233 (2012).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Gupta, G. P., et al. Mediators of vascular remodelling co-opted for sequential steps in lung metastasis. Nature. 446 (7137), 765-770 (2007).
- Kosaka, N., et al. Neutral sphingomyelinase 2 (nSMase2)-dependent exosomal transfer of angiogenic microRNAs regulate cancer cell metastasis. J Biol Chem. 288 (15), 10849-10859 (2013).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Jaskelioff, M., et al. Telomerase deficiency and telomere dysfunction inhibit mammary tumors induced by polyomavirus middle T oncogene. Oncogene. 28 (48), 4225-4236 (2009).
- Si, L. L., Lv, L., Zhou, W. H., Hu, W. D. Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6540-6546 (2015).
- Weng, D., et al. Metastasis is an early event in mouse mammary carcinomas and is associated with cells bearing stem cell markers. Breast Cancer Res. 14 (1), R18 (2012).
