Een kinetische fluorescentie gebaseerde Ca2 + mobilisatie Assay te identificeren van G eiwit-gekoppelde Receptor agonisten en antagonisten Allosteric modulatoren
Summary
De beschreven cellulaire assay is ontworpen voor de identificatie van CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerende agenten die remmen of deze te stimuleren, concurrerend of allosterically, de intracellulaire Ca2 + release geïnitieerd door CXCR4 activering.
Abstract
G eiwit-gekoppelde receptoren (GPCRs) zijn van groot belang voor de farmaceutische industrie, omdat ze betrokken bij vele ziekten bij de mens zijn en goed gevalideerde streefniveaus voor therapeutische interventie. Ontdekking van loodverbindingen, met inbegrip van kleine synthetische moleculen, die een specifiek remmende werking van de receptor functie, is een belangrijke eerste stap in de Geneesmiddelenontwikkeling en is afhankelijk van robuuste, gevoelige en specifieke cel-gebaseerde testen. Hier beschrijven we een kinetische cellulaire assay met een fluorescerende uitlezing hoofdzakelijk ontworpen om te identificeren specifieke receptor antagonisten die een remmende werking van de intracellulaire Ca2 + release opgeroepen bij de activering van de CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) door haar endogene ligand, de CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). Een belangrijk voordeel van deze methode is dat ook hierdoor screening van verbindingen begiftigd met intrinsieke agonistic eigenschappen (d.w.z., verbindingen die aanleiding kunnen geven tot een toename van de intracellulaire Ca2 + concentratie in de afwezigheid van CXCL12) of verbindingen moduleren van de receptor functie via interactie met allosteric bandplaatsen (d.w.z., positieve en negatieve allosteric modulatoren (PAMs en NAMs, respectievelijk)). Op de keerzijde, kunnen autofluorescent verbindingen interfereren met de bepaling van uitlezing, waardoor het belemmeren van betrouwbare data interpretatie. Waarschijnlijk kan deze test worden uitgevoerd, met minimale aanpassingen, als een generiek geneesmiddel ontdekking assay voor vele andere GPCRs waarvan de Activering tot een vrijval van intracellulaire Ca2 leidt +.
Introduction
GPCRs zijn een belangrijke superfamilie van cel-oppervlakte-eiwitten die signaaltransductie cascades van extracellulaire ligand bindende activeren. Zij kunnen worden geactiveerd door een grote verscheidenheid van stimuli met inbegrip van peptiden, eiwit hormonen, biogenic amines en lipiden, wat in de opening van uiteenlopende intracellulaire signaalroutes en uiteindelijk biologische reacties1,2 resulteert . Bovendien GPCRs zijn betrokken bij velen, als niet alle, ontwikkelings- en fysiologische processen en vele ziekten bij de mens worden geassocieerd met disfunctionele GPCR signalering of receptor overexpressie. GPCRs behoren daarom tot de meest gevalideerde farmacologische doelen in geneeskunde1,3.
Meestal begint een GPCR workflow voor de ontdekking van de drug met cellulaire screening tests waarmee de identificatie van stoffen zoals kleine molecules, monoklonale antilichamen en peptiden die de activiteit van een bepaalde GPCR kunnen moduleren. In GPCR drugontdekking vele verschillende soorten tests bestaan om te zoeken naar dergelijke verbindingen, zijn waarvan de meeste compatibel met midden – tot high-throughput screening campagnes. De meest gebruikte tests omvatten receptor bindende experimenten, fluorescentie- of luminescentie gebaseerd testen schommelingen in het niveau van de zogenaamde secundaire boodschappers (b.v., Ca2 +, cyclisch adenosinemonofosfaat (AMP)), fenotypische opsporen screening tests, en de aanwerving van de β-arrestin testen4. De keuze voor een bepaald soort assay kan afhangen van meerdere factoren, maar wordt ook bepaald door voorafgaande kennis omtrent de signalering eigenschappen van een bepaalde GPCR. Agonist binden aan een GPCR induceert een conformationele verandering katalyseren van de uitwisseling van guanidine (III) difosfaat (BBP) voor guanidine trifosfaat (GTP) op de α-subunit van heterotrimeric G eiwitten. Vervolgens de Gα-GTP subeenheid distantieert van de G-βγ -subunit en beide subeenheden signaalroutes verder zal starten. Hydrolyse van de GTP-molecuul en de daaropvolgende hernieuwde vereniging van de G-α– BBP en Gβγ subeenheden zal herstellen het G-eiwit in de inactieve conformatie5,6. Gebaseerd op volgorde gelijkenis van de Gα subeenheid verschillende soorten G eiwitten zijn gedefinieerd (Gs, GikGq, G12/13)7. Signalering via de G-α subeenheid geeft aanleiding tot verschillende typische reacties zoals de verhoging (via Gs) of daling (via Gik) van cyclisch ADENOSINEMONOFOSFAAT productie en intracellulaire Ca2 + mobilisatie (via Gq)5 ,7. Gβγ subeenheden kunnen ook voor het opwekken van intracellulaire effector trajecten. Bijvoorbeeld, na activatie van Gik-gekoppelde GPCRs, Gβγ kunnen direct stimuleren phospholipase C (PLC-β) te produceren inositol trifosfaat (IP-3) die als trigger de vrijlating van Ca2 + van intracellulaire winkels7 fungeert . Na receptor activering, zijn GPCRs phosphorylated door GPCR kinases (GRKs) ter bevordering van de interactie met β-arrestins. Dit proces wordt beëindigd G eiwit signalering en leidt tot receptor desensibilisatie en uiteindelijk internalisering. Β-arrestins kunnen ook multi moleculaire complexen die kunnen leiden tot andere signaalroutes onafhankelijk van signalering van8G-proteïne vormen.
Binnen de onderfamilie van chemokine receptoren, de Gik-gekoppelde CXCR4 is een GPCR die veel belangstelling heeft opgeworpen als een veelbelovende doelwit voor drugontdekking. Gelet op haar gevestigde rol als een belangrijke co receptor voor humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) 1 werden virale ingang en infectie, verbindingen richten CXCR4 in eerste instantie ontwikkeld als anti-HIV drug kandidaten9. Meer recentelijk, een groeiend lichaam van bewijsmateriaal heeft gewezen op een belangrijke rol voor CXCR4 tumorvorming en kanker uitzaaiingen, waardoor het een goed gevalideerde therapeutisch doel in oncologie evenals10. CXCR4 wordt sterk uitgedrukt in meer dan twintig soorten menselijke kanker en overleving van de cel van de tumor van besturingselementen, proliferatie, en migratie alsmede tumor-gerelateerde angiogenese10. CXCR4 antagonisten van verschillende chemische klassen geweest eerder beschreven11,12, maar alleen het kleine molecuul dat amd3100 is momenteel goedgekeurd voor gebruik in de kliniek als een stamcel mobilisatie agent gebruikt tijdens de behandeling van het lymfoom en myeloom patiënten13,14. Klinische proeven zijn aan de gang om de veiligheid en de werkzaamheid van verschillende andere CXCR4 antagonisten in verschillende ziekten bij de mens, maar met een sterke focus op oncologie12. Gezien de vele mogelijke toepassingen voor CXCR4 antagonisten, is het zoeken naar nieuwe verbindingen met verbeterde farmacokinetische eigenschappen, verbeterde biologische beschikbaarheid of potentieel minder bijwerkingen gerechtvaardigd.
Hierin een kinetische fluorescentie gebaseerde cellulaire assay hoofdzakelijk gebruikt voor scherm voor verbindingen kunnen remmen CXCR4 wordt beschreven. De fluorescerende meting van deze methode is gebaseerd op de tijdelijke verhoging van de intracellulaire Ca2 + concentratie opgeroepen op CXCR4 activering door de endogene agonist, de chemokine ligand CXCL12 (voorheen bekend als stromale cel afgeleide factor 1α) SDF1-α)), en de potentiële inhibitie van deze CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie door bepaalde verbindingen. In deze test, worden U87 menselijke glioblastoma cellen stabiel uiting van de menselijke CXCR4 receptor gebruikt. Deze cellen missen op hetzelfde moment, endogene uitdrukking van CXCR7, een verwante chemokine receptor die ook CXCL1215,16,17 bindt. CXCR7 is eerder ook aangetoond te kunnen vormen van de heterodimers met CXCR4, waardoor het moduleren van de signalering eigenschappen van deze laatste receptor18. Schommelingen in de hoeveelheid intracellulair Ca2 + gemedieerd door CXCR4 worden gecontroleerd door het laden van de CXCR4+ cellen met fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, een cel-permeabele hoge affiniteit fluorescerende Ca2 +-bindende kleurstof. Fluo-2 AM is een één golflengte fluorescerende molecule die kan worden enthousiast op 490 nm, terwijl de fluorescentie van de emissie is gemeten op 520 nm. Deze emissie-fluorescentie verhoogt op Ca2 + binding, met een groot dynamisch bereik tussen de Ca2 +-gebonden en ongebonden staat. De toename van fluorescent signaal is van voorbijgaande aard, die zich voordoen binnen een tijdspanne van een paar minuten, en daarna zal vergaan. De piekhoogte van de verdere correlaten van fluorescerende emissie met het niveau van de receptor activering. De test zelf wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescentie microplate lezer uitgerust met een CCD geïntensiveerd (ICCD) camera die beschikt over een geïntegreerde pipetting systeem waarmee de standaardisatie van de pipetting stappen in de analyse (Zie Tabel van materialen) . Bovendien, is de gelijktijdige meting van het fluorescerende signaal in ieder putje van een microplate een ander belangrijk voordeel van de lezer van de fluorescentie die wordt gebruikt. Tijdens het eerste deel van de bepaling die de verbindingen onderzochte (bijvoorbeeld, een panel van kleine moleculen met een vaste concentratie of in een verdunningsreeks) worden toegevoegd aan de fluo-2 AM geladen CXCR4+ U87 cellen gevolgd door een ~ 10 min incubatietijd tijdens welke de mogelijke agonistic effect van de verbindingen wordt continu gemeten in real-time. Vervolgens de endogene agonist (d.w.z.CXCL12) wordt toegevoegd aan de cellen om te roepen een CXCR4-gemedieerde voorbijgaande verhoging van het niveau van intracellulaire Ca2 +. Tijdens dit deel van de bepaling kan de potentiële antagonistische activiteit van de geteste stoffen worden geëvalueerd. Een schematisch overzicht van de bepaling in de algemene workflow wordt gepresenteerd in Figuur 1.
Hoewel deze Ca2 + mobilisatie test is vooral gebruikt voor het identificeren en bepalen de remmende potentie van concurrerende CXCR4 antagonisten (d.w.z., verbindingen, waardoor de endogene agonist om te binden en stimuleren de receptor), het ook receptor agonisten kan identificeren en, bovendien, verbindingen die oefenen hun functie door inbinden op allosteric sites (dat wil zeggen, websites die topografisch van de orthosteric binding site bezet door de endogene agonist afwijken). De laatstgenoemde categorie van verbindingen en voorbeelden van allosteric agonisten PAMs en NAMs19,20. Overwegende dat specifieke receptor antagonisten evenals NAMs de CXCL12-geïnduceerde Ca2 + reactie remmen zou, PAMs dit antwoord zou verbeteren (Zie ook bespreking sectie). Hoewel de bepaling hierin specifiek CXCR4 doelen beschreven, wordt verwacht dat deze methode kan worden toegepast op andere GPCRs met minimale optimalisatie inspanning, tenminste als ze het signaal via de vrijlating van intracellulaire Ca2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
De Ca2 +-mobilisatie assay hierin beschreven eerder blijkt te zijn een waardevol instrument te identificeren en te karakteriseren receptorantagonisten targeting CXCR417. Verwacht wordt, echter dat deze methode worden meer in het algemeen op een grote groep van andere GPCRs die leiden een cytosolische Ca2 + release op hun activering, toegepast kan tot zoals geïllustreerd voor de verwante chemokine receptor CCR5. Overwegende dat bij CCR5 precies dezelfde experimentele omstandi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedank Eric Fonteyn en Geert Schoofs voor uitstekende technische bijstand. Dit werk werd ondersteund door de KU Leuven (verlenen neen. PF/10/018), het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, neen verlenen. G.485.08), en de Fondation chalets Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
