Eine kinetische Fluoreszenz basierenden Ca2 + Mobilisierung Assay, G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Agonisten und Antagonisten allosterische Modulatoren zu identifizieren
Summary
Beschriebenen zelluläre Assay dient zur Identifizierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4)-interaktiver Agenten, die hemmen oder fördern, kompetitiv oder allosterically, die intrazelluläre Ca2 + Release von CXCR4 Aktivierung initiiert.
Abstract
G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) sind für die pharmazeutische Industrie von großer Bedeutung, da sie bei vielen menschlichen Krankheiten beteiligt sind und gut validierte für eine therapeutische Intervention Zielvorgaben. Entdeckung von Bleiverbindungen, einschließlich kleine synthetische Moleküle, die speziell die Rezeptor-Funktion hemmen, ist ein erster wichtiger Schritt in der Medikamentenentwicklung und stützt sich auf sensible, spezifische und robuste zellbasierte Assays. Hier beschreiben wir einen kinetische zellularen Assay mit einer fluoreszierenden Anzeige in erster Linie entwickelt, um spezifischen Rezeptor-Antagonisten zu identifizieren, die die intrazelluläre Ca2 + Freigabe, hervorgerufen durch die Aktivierung der CXC-Chemokin-Rezeptor 4 (CXCR4) hemmen, indem seine endogenen Liganden, der CXC-Chemokin-Liganden 12 (CXCL12). Ein entscheidender Vorteil dieser Methode ist, dass es ermöglicht auch Screening von Verbindungen mit agonistischen Eigenschaften (d.h., Verbindungen, die einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration in der Abwesenheit von CXCL12 zu entlocken) oder Verbindungen ausgestattet Modulation der Rezeptor-Funktion durch Interaktion mit allosterische Bindungsstellen (d.h., positive und negative allosterische Modulatoren (PAMs und NAMs, beziehungsweise)). Auf der anderen Seite können die Probe auslesen, dadurch behindert zuverlässige Dateninterpretation Autofluorescent Verbindungen beeinträchtigen. Am ehesten kann dieser Assay mit minimalen Anpassungen als ein generisches Medikament Entdeckung Assay für viele andere GPCRs umgesetzt werden, von denen die Aktivierung zu einer Freisetzung von intrazellulären Ca2 führt +.
Introduction
GPCRs sind eine wichtige Superfamilie Zelle Oberflächenproteine, die Transduktion Signalkaskaden bei extrazellulären Liganden Bindung zu aktivieren. Sie können durch eine Vielzahl von Reizen wie Peptide, Proteinhormone, biogene Amine und Lipide, aktiviert werden die Ergebnisse in der Einleitung der unterschiedlichen intrazellulären Signalwege und schließlich biologischen Reaktionen1,2 . Darüber hinaus GPCRs engagieren sich in vielen, wenn nicht alle Entwicklungs- und physiologische Prozesse und viele menschliche Erkrankungen werden mit dysfunktionalen GPCR-Signalisierung oder Rezeptor-Überexpression in Verbindung gebracht. GPCRs gehören daher die meisten validierten pharmakologische Ziele in Medizin1,3.
In der Regel beginnt ein GPCR Drug Discovery Workflow zellulären Screening-Tests ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen wie kleine Moleküle, monoklonale Antikörper und Peptide, die die Aktivität von bestimmten GPCR modulieren können. In GPCR Arzneimittelforschung, dass viele verschiedene Arten von Tests vorhanden sind, um solche Verbindungen zu suchen sind die meisten davon mit Mitte – zum Hochdurchsatz-Screening Kampagnen kompatibel. Die am häufigsten verwendeten Assays gehören Rezeptor-Bindung-Experimente, Fluoreszenz und Lumineszenz basierte Assays erkennen die Schwankungen der so genannte sekundäre Botenstoffe (z.B. Ca2 +, zyklische Adenosin Monophosphate (AMP)), phänotypische Screening-Assays und β-arrestin Rekrutierung assays4. Die Wahl für eine bestimmte Art von Assay kann von mehreren Faktoren abhängen, sondern richtet sich auch nach Vorwissen über die Signalisierung Eigenschaften einer gegebenen GPCR. Agonisten binden an ein GPCR induziert eine Konformationsänderung katalysieren den Austausch von Guanidin diphosphat (BIP) für Guanidin Triphosphat (GTP) auf die α-Untereinheit des Heterotrimeric G-Proteine. Anschließend die Gα-GTP-Untereinheit distanziert sich von den G-βγ -Untereinheit und beide Untereinheiten werden weitere Signalwege zu initiieren. Hydrolyse der GTP-Molekül und anschließende erneute Vereinigung von Gα– BIP und Gβγ Untereinheiten werden das G-Protein in seine inaktiven Konformation5,6wiederherzustellen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit der G-α -Untereinheit werden verschiedene Arten von G-Proteinen definiert (G-s, Gich, GQ, G12/13)7. Signalisierung über die G-α Untereinheit gibt steigen mehrere typische Reaktionen wie z. B. die Erhöhung (über G-s) oder verringern (über Gich) zyklisches AMP Produktions-und intrazellulären Ca2 + Mobilisierung (über G-Q)5 ,7. Gβγ Untereinheiten sind auch in der Lage, intrazelluläre Effektor Wege zu induzieren. Zum Beispiel bei einer Aktivierung der Gich-gekoppelten GPCRs, Gβγ können direkt stimulieren Phospholipase C (PLC-β), Inositol-Triphosphat (IP3) zu produzieren, die die Freisetzung von Ca2 + von intrazellulären Speichern7 auslöst . Nach der Aktivierung der Rezeptor sind GPCRs phosphoryliert von GPCR Kinasen (GRKs) die Interaktion mit β-Arrestins fördert. Dieser Prozess endet G Protein signaling und führt zu Rezeptor Desensibilisierung und schließlich Verinnerlichung. Β-Arrestins sind auch in der Lage, Multi-molekulare komplexe bilden, die andere Signalwege unabhängig von G Protein signaling8auslösen können.
Innerhalb der Unterfamilie der Chemokin-Rezeptoren, die Gich-gekoppelten CXCR4 ist ein GPCR, die viel Interesse als ein viel versprechendes Ziel für die Wirkstoffforschung ausgelöst hat. Angesichts seiner etablierten Rolle als eine große Ko-Rezeptor für Human Immunodeficiency Virus (HIV-1) 1 wurden virale Eintrag und Infektion, Verbindungen gezielt CXCR4 zunächst als Anti-HIV-Medikament Kandidaten9entwickelt. Vor kurzem hat eine wachsende Zahl von Beweisen auf eine wichtige Rolle für CXCR4 in Tumorgenese und Krebs Metastasen, so dass es eine gut validierte therapeutische Ziel in der Onkologie sowie10hingewiesen. CXCR4 ist hoch in mehr als zwanzig Arten von Krebserkrankungen und Steuerelemente Tumor Zelle überleben, Verbreitung, sowie Migration und im Zusammenhang mit Tumor-Angiogenese10ausgedrückt. CXCR4-Antagonisten von verschiedenen chemischen Klassen wurden zuvor beschriebenen11,12, sondern nur das kleine Molekül AMD3100 derzeit für den Einsatz in der Klinik als Stammzell-Mobilisierung Agent verwendet während der Behandlung des Lymphoms zugelassen und Myelom-Patienten13,14. Klinische Studien sind im Gange, die Sicherheit und Wirksamkeit von mehreren anderen CXCR4-Antagonisten in verschiedenen Krankheiten des Menschen, aber mit einem starken Fokus auf Onkologie12bewertet. Angesichts der vielen Anwendungsmöglichkeiten für CXCR4-Antagonisten, ist die Suche nach neuartigen Verbindungen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften, verbesserte Bioverfügbarkeit oder möglicherweise weniger Nebenwirkungen gerechtfertigt.
Hierin eine kinetische Fluoreszenz basierende zelluläre Assays in erster Linie verwendet, um Bildschirm für Verbindungen in der Lage, Hemmung CXCR4 wird beschrieben. Die fluoreszente Messung dieser Methode basiert auf der vorübergehende Anstieg der intrazellulären Ca2 + Konzentration auf CXCR4 Aktivierung durch die endogene Agonist, der Chemokin-Liganden CXCL12 (früher bekannt als Stromazellen Zelle Faktor 1α abgeleitet (hervorgerufen SDF1-α)), und die möglichen Hemmung dieser CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion durch bestimmte Verbindungen. In diesem Test werden U87 menschlichen Glioblastom-Zellen stabil mit dem Ausdruck des menschlichen Rezeptors CXCR4 verwendet. Zur gleichen Zeit fehlt diese Zellen endogene Expression von CXCR7, einem Verwandten Chemokin-Rezeptor, der auch CXCL1215,16,17 bindet. CXCR7 zuvor auch nachweislich bilden Heterodimere mit CXCR4, werden dadurch modulieren die Signalisierung Eigenschaften dieser letzteren Rezeptor-18. Die Schwankungen der intrazellulären Ca2 + von CXCR4 vermittelt werden durch das Laden der CXCR4 überwacht+ Zellen mit Fluo-2 Acetoxymethyl (AM) Ester, eine Zelle durchlässig hohe Affinität fluoreszierende Ca2 +-bindende Farbstoff. Fluo-2 Uhr ist eine einzelne Wellenlänge fluoreszierende Molekül, das auf 490 angeregt werden kann nm während der Emission Fluoreszenz bei 520 gemessen wird nm. Diese Fluoreszenz Emission erhöht sich auf Ca2 + Bindung mit einem großen Dynamikbereich zwischen Ca2 +-gebunden und ungebunden Zustand. Die Zunahme der Fluoreszenzsignal ist vergänglich, auftreten innerhalb einer Zeitspanne von ein paar Minuten, und wird danach verfallen. Die Peakhöhe der die Fluoreszenz Emission weiterer korreliert mit dem Niveau der Rezeptor-Aktivierung. Der Test selbst erfolgt mit einem Fluoreszenz Mikrotestplatte Reader verfügt über eine intensivierte CCD (ICCD) Kamera, die ein integriertes Pipettierens System besitzt, die Standardisierung der Pipettier Schritte in der Probe ermöglicht (siehe Tabelle der Materialien) . Darüber hinaus ist die gleichzeitige Messung von das Fluoreszenzsignal in alle Vertiefungen der einer Mikrotestplatte ein weiterer wesentlicher Vorteil der Fluoreszenz-Leser, die verwendet wird. Während der erste Teil des Tests die Verbindungen untersucht (z.B. eine Gruppe von kleinen Molekülen in einer festen Konzentration oder in einer Verdünnungsreihe), um die Fluo-2 Uhr hinzugefügt werden geladen CXCR4+ U87 Zellen gefolgt von einer ~ 10 min Inkubationszeit während dessen wird die potenzielle agonistische Wirkung der Verbindungen kontinuierlich in Echtzeit gemessen. Dann die endogenen Agonisten (d. h.CXCL12) wird hinzugefügt, um die Zellen zu einen CXCR4-vermittelten vorübergehenden Anstieg der Ebene der intrazellulären Ca2 +evozieren. In diesem Teil des Tests kann die potenziellen antagonistische Aktivität der getesteten Verbindungen ausgewertet werden. Ein schematischer Überblick über die Assay allgemeinen Workflow ist in Abbildung 1dargestellt.
Obwohl in erster Linie diese Ca2 + Mobilisierung Assay verwendet worden ist, zu identifizieren und zu bestimmen, die inhibitorische Potenz von wettbewerbsfähigen CXCR4-Antagonisten (d.h., Verbindungen, die verhindern, dass die endogene Agonisten stimulieren den Rezeptor zu binden), es auch -Rezeptor-Agonisten identifizieren können und darüber hinaus Verbindungen, die ihre Funktion durch die Bindung an allosterische Standorten (z.B. Websites, die topographisch unterscheiden sich von den Orthosteric-Bindungsstelle von endogenen Agonisten besetzt) ausüben. Beispiele für die zweite Kategorie von Verbindungen allosterische Agonisten und PAMs und NAMs19,20. Während spezifischen Rezeptor-Antagonisten sowie NAMs CXCL12-induzierte Ca2 + Reaktion hemmen würde, PAMs würde diese Reaktion zu verbessern (siehe auch Diskussion Abschnitt). Obwohl der Test hier speziell CXCR4 Ziele beschrieben, es wird davon ausgegangen, dass diese Methode auf andere GPCRs mit minimalen Optimierung Aufwand mindestens angewendet werden kann wenn sie über die Freigabe des intrazellulären Ca2 +signalisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ca2 +-Mobilisierung Assay beschriebenen hat zuvor gezeigt, dass ein wertvolles Instrument zu identifizieren und zu charakterisieren, targeting CXCR417-Rezeptor-Antagonisten. Es ist, jedoch erwartet, dass diese Methode im Allgemeinen kann für eine große Gruppe von anderen GPCRs, die eine cytosolische Ca2 + Version auf ihre Aktivierung auslösen angewendet werden wie für den entsprechenden Chemokin-Rezeptor CCR5 dargestellt. Im Falle von CCR5 genau die gleichen Versuchsb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten Eric Fonteyn und Geert Schoofs für ausgezeichnete technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde unterstützt von der KU Leuven (keine zu gewähren. PF/10/018), den Fonds Voor Wetenschappelijk Onderzoek-(FWO, Nein zu gewähren. G.485.08), und die Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
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