En kinetisk fluorescens-baserte Ca2 + mobilisering analysen identifisere G Protein-kombinert reseptor agonister antagonister og Allosteric modulatorer
Summary
Beskrevet mobilnettet analysen er utformet for identifikasjon av CXC chemokine reseptor 4 (CXCR4)-samspill agenter som hemme eller stimulere, enten konkurransedyktig eller allosterically, intracellulær Ca2 + utgivelsen initiert av CXCR4 aktivisering.
Abstract
G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) er av stor betydning for den farmasøytiske industrien som de er involvert i mange menneskelige sykdommer og ta godt godkjente mål for terapeutisk intervensjon. Oppdagelsen av bly stoffer, inkludert små syntetiske molekyler, som spesielt hemme reseptorens funksjonen, er et viktig første skritt i utviklingen og avhengig av sensitive, spesifikk og robust cellebasert analyser. Her beskriver vi en kinetisk mobilnettet analysen med et fluorescerende avlesning hovedsakelig laget for å identifisere reseptor-spesifikke antagonister som hemmer intracellulær Ca2 + utgivelsen utløste ved aktivering av CXC chemokine reseptoren 4 (CXCR4) av sin endogene ligand, CXC chemokine ligand 12 (CXCL12). En viktig fordel med denne metoden er at det gjør også screening av forbindelser med iboende agonistic egenskapene (dvs., forbindelser fremlokkende en økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon i fravær av CXCL12) eller forbindelser modulerende reseptorens funksjon via interaksjon med allosteric bindende (dvs, positive og negative allosteric modulatorer (PAMs og NAMs, henholdsvis)). På ned side, kan autofluorescent forbindelser forstyrre analysens avlesning, og dermed hindrer pålitelige data tolkning. Sannsynligvis kan denne analysen gjennomføres, med minimal tilpasninger, som en fellesbetegnelse stoffet funnet analysen for mange andre GPCRs hvorav aktivering fører til en utgivelse av intracellulær Ca2 +.
Introduction
GPCRs er en viktig gruppe av cellen overflaten proteiner som aktiverer signal signaltransduksjon cascades på ekstracellulære ligand binding. De kan aktiveres av et stort utvalg av stimuli inkludert peptider, protein hormoner, biogenic aminer og lipider, som resulterer i initiering av ulike intracellulær signalveier og til slutt biologiske svar1,2 . Videre GPCRs er involvert i mange, om ikke alle, utviklingsmessige og fysiologiske prosesser og mange menneskelige sykdommer er assosiert med dysfunksjonelle GPCR signalering eller reseptoren overuttrykte. GPCRs er derfor blant de mest validert farmakologiske målene i medisin1,3.
Vanligvis starter en GPCR drug discovery arbeidsflyten med cellular screening analyser aktivere identifikasjon av forbindelser som små molekyler, monoklonale antistoffer og peptider som kan modulerer aktiviteten til en bestemt GPCR. I GPCR stoffet funnet mange forskjellige typer analyser eksisterer for å søke etter slike forbindelser, er de fleste som kompatible med midt – til høy gjennomstrømming screening kampanjer. De mest brukte analyser inkluderer reseptor bindende eksperimenter, fluorescens eller luminescence basert analyser oppdage svingninger i nivået av såkalte sekundære messengers (f.eks, Ca2 +, syklisk adenosin monofosfat (AMP)), fenotypiske screening analyser og β-arrestin rekruttering søk4. Valget for en bestemt type analysen kan avhenge av flere faktorer, men bestemmes også av forutgående kunnskap om signalnettverk egenskapene til en gitt GPCR. Agonistiske binding til en GPCR induserer en conformational endring utløse utveksling av guanidine diphosphate (BNP) for guanidine trifosfat (GTP) på α-delenhet heterotrimeric G proteiner. Senere Gα-GTP delenhet dissociates fra Gβγ delenhet og begge underenheter vil starte videre signalveier. Hydrolyse GTP-molekylet og påfølgende re sammenslutning av Gα– BNP og Gβγ underenheter vil gjenopprette G protein i sine inaktive konformasjon5,6. Basert på sekvens likheten av Gα delenhet defineres forskjellige typer G proteiner (GsGjegGq, G12/13)7. Signalene via Gα delenhet gir opphav til flere typiske svar som økningen (via Gs) eller redusere (via Gjeg) av syklisk AMP produksjon og intracellulær Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ tenkes kan også å indusere intracellulær effektor trasé. For eksempel ved aktivering av Gjeg-kombinert GPCRs, Gβγ kan direkte stimulerer fosfolipase C (PLC-β) å produsere inositol trifosfat (IP3) som utløser utgivelsen av Ca2 + fra intracellulær butikker7 . Etter reseptor aktivisering, GPCRs fosforylert av GPCR kinaser (GRKs) som fremmer interaksjon med β-arrestins. Denne prosessen avslutter G protein signalering og fører til reseptoren desensitization og til slutt internalisering. Β-arrestins kan også danne flere molekylær komplekser som kan utløse andre signalveier uavhengig av G protein signalering8.
I gruppe av chemokine reseptorer, den Gjeg-kombinert CXCR4 er en GPCR som har reist mye interesse som en lovende mål for medisiner. Gitt sin etablerte rolle som en stor co reseptor for humant immunsviktvirus 1 (HIV-1) ble viral oppføringen og infeksjon, forbindelser målretting CXCR4 opprinnelig utviklet som anti-HIV narkotika kandidater9. Flere nylig, en voksende mengde bevis har pekt på en viktig rolle for CXCR4 i tumorigenesis og kreft metastasering og et godt validert terapeutisk mål i onkologi samt10. CXCR4 er svært uttrykt i mer enn 20 typer menneskelig kreft og kontroller svulst celle overlevelse, spredning, og overføring samt svulst-relaterte angiogenese10. CXCR4 antagonister forskjellige kjemiske klasser har tidligere blitt beskrevet11,12, men bare i små molekyl AMD3100 er godkjent for bruk i klinikken som stilk cellen mobilisering agent brukt under behandling av lymphoma og myelom pasienter13,14. Kliniske studier er pågående evaluere effekten av flere andre CXCR4 antagonister i ulike menneskelige sykdommer, men med et sterkt fokus på onkologi12og sikkerhet. Gitt de mange mulige programmene for CXCR4 antagonister, er søk for romanen forbindelser med forbedret farmakokinetiske egenskapene, forbedret biotilgjengelighet eller potensielt mindre bivirkninger garantert.
Her, en kinetisk fluorescens-baserte mobilnettet analysen primært brukes til skjermen for forbindelser kan hemme CXCR4 er beskrevet. Fluorescerende måling av denne metoden er basert på forbigående økningen av intracellulær Ca2 + konsentrasjonen fremkalt ved CXCR4 aktivering av sin endogene Agonistiske, chemokine ligand CXCL12 (tidligere kjent som stromal cell avledet faktor 1α ( SDF1-α)), og potensielle hemming av dette CXCL12-indusert Ca2 + svaret av bestemt forbindelser. I denne analysen brukes U87 menneskelige glioblastom celler stabilt uttrykke menneskelige CXCR4 reseptoren. Samtidig mangler disse cellene endogene uttrykk for CXCR7, en relaterte chemokine reseptor som også binder CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidligere også vist å være stand til å danne heterodimerer med CXCR4, og dermed modulerende signalnettverk egenskapene for denne siste reseptor18. Svingninger i nivået av intracellulær Ca2 + formidlet av CXCR4 overvåkes av lasting av CXCR4+ celler med fluo-2 acetoxymethyl (AM) ester, en celle-permeable høy affinitet fluorescerende Ca2 +-bindende fargestoff. Fluo-2 AM er et enkelt bølgelengde fluorescerende molekyl som kan være spent på 490 nm mens dens utslipp fluorescens måles på 520 nm. Denne utslipp fluorescens øker på Ca2 + bindende, med et stort dynamisk område mellom Ca2 +-bundet og ubundet tilstand. Økningen i fluorescerende signalet er forbigående, innenfor et tidsintervall på noen minutter, og vil forfalle etterpå. Topp høyden av fluorescerende utslipp ytterligere korrelerer med nivået på reseptor aktivisering. Analysen selv utføres ved hjelp av en fluorescens microplate leser utstyrt med en forsterket CCD (ICCD) kamera som har et integrert pipettering system som gir standardisering av pipettering trinnene i analysen (se Tabell for materiale) . I tillegg er samtidig måling av fluorescerende signalet i alle brønnene av en microplate en annen viktig fordel av fluorescens leseren som brukes. Under først del av analysen forbindelser under etterforskning (f.eks, et panel av små molekyler på en fast konsentrasjon eller en fortynning serie) legges til fluo-2 AM lastet CXCR4+ U87 celler etterfulgt av en ~ 10 min incubation periode Når måles kontinuerlig potensielle agonistic effekten av forbindelser i sanntid. Deretter den endogene Agonistiske (dvs.CXCL12) legges til cellene til å fremkalle et CXCR4-mediert forbigående økning i nivået av intracellulær Ca2 +. Under denne delen av analysen kan potensielle antagonistiske aktiviteten av testet forbindelser evalueres. En skjematisk oversikt over analysens generelle arbeidsflyt vises i figur 1.
Selv om denne Ca2 + mobilisering analysen er primært brukt til å identifisere og fastsette hemmende styrken på konkurrerende CXCR4 antagonister (dvs., forbindelser som hindrer den endogene Agonistiske å binde og stimulere reseptoren) det også kan identifisere reseptor agonister, og i tillegg forbindelser som utøve sin funksjon av bindingen på allosteric nettsteder (dvs., nettsteder som topografisk avviker fra webområdet for orthosteric-binding av endogene Agonistiske). Allosteric agonister og PAMs og NAMs19,20er eksempler på sistnevnte kategori av forbindelser. Mens reseptor-spesifikke antagonister samt NAMs ville hemme CXCL12-indusert Ca2 + svaret, PAMs vil øke dette svaret (se også diskusjon delen). Selv om analysen beskrevet her spesielt mål CXCR4, det er forventet at denne metoden kan brukes på andre GPCRs med minimal optimalisering innsats, minst hvis de signal via utgivelsen av intracellulær Ca2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ca2 +-mobilisering analysen beskrevet her har tidligere vist seg å være et verdifullt verktøy for å identifisere og karakterisere reseptor antagonister målretting CXCR417. Det er imidlertid forventet at denne metoden kan generelt brukes til en stor gruppe av andre GPCRs som utløser en cytosolic Ca2 + utgivelse på deres aktivisering, som illustrert for relaterte chemokine reseptoren CCR5. Mens nøyaktig samme eksperimentelle forhold kan brukes i CCR5, må flere trinn i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke Eric Fonteyn og Geert Schoofs for utmerket kundestøtte. Dette arbeidet har vært støttet av KU Leuven (gi nei. PF/10/018), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, gir ingen. G.485.08), og Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
