En kinetisk fluorescens-baserad certifikatutfärdare2 + mobilisering analysen identifiera G-proteinkopplade receptoragonister och antagonister Allosteriska modulatorer
Summary
Beskrivna cellulära analysen är utformad för identifiering av CXC chemokine receptor 4 (CXCR4)-interagerande agenter som hämmar eller stimulera, antingen konkurrenskraftigt eller allosterically, intracellulära Ca2 + frisättning initierats av CXCR4 aktivering.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (varandra) är av stor betydelse för läkemedelsindustrin som de är involverade i många sjukdomar och inkluderar väl validerad mål för terapeutisk intervention. Upptäckten av blyföreningar, inklusive små syntetiska molekyler, som specifikt hämmar receptorns funktion, är ett viktigt inledande steg i läkemedelsutveckling och förlitar sig på känsliga, specifika och robust cellbaserade analyser. Här, vi beskriver en kinetic cellulära analysen med en fluorescerande avläsning som primärt syftar till att identifiera receptor-specifika antagonister som hämmar den intracellulära Ca2 + release frammanade vid aktivering av CXC chemokine receptorn 4 (CXCR4) genom dess endogena liganden, CXC chemokine liganden 12 (CXCL12). En viktig fördel med denna metod är att den också kan screening av föreningar som begåvats med inneboende agonistiska egenskaper (dvs., föreningar framkalla en ökning av intracellulära Ca2 + koncentrationen i avsaknad av CXCL12) eller föreningar modulerande receptorns funktion via interaktion med Alloster bindningsställen (dvs, positiva och negativa Allosteriska modulatorer (PAMs och NAMs, respektive)). På den negativa sidan, kan autofluorescent föreningar störa analysens avläsning, vilket försvårar tolkning av tillförlitliga data. Mest sannolikt kan denna analys genomföras, med minimal anpassning, som en generiska läkemedel upptäckt analys för många andra varandra varav aktiveringen leder till en frisättning av intracellulära Ca2 +.
Introduction
Varandra är en viktig superfamilj av cell ytproteiner som aktiverar signaltransduktion cascades vid extracellulära ligand bindning. De kan aktiveras av en stor mängd stimuli inklusive peptider, proteinhormoner, Biogeniska aminer och lipider, vilket resulterar i inledandet av olika intracellulära signalvägar och så småningom biologiska svar1,2 . Dessutom varandra är inblandade i många, om inte alla, utvecklingsmässiga och fysiologiska processer och många sjukdomar är associerade med dysfunktionella GPCR signalering eller receptor överuttryck. Varandra är därför bland de mest validerade farmakologiska mål i medicin1,3.
Vanligtvis startar en GPCR drug discovery arbetsflödet med cellulära screening-analyser som möjliggör identifiering av föreningar såsom små molekyler, monoklonala antikroppar och peptider som kan modulera aktiviteten av en viss GPCR. Av GPCR läkemedelsutveckling finns många olika typer av analyser för att söka efter sådana föreningar, är varav de flesta kompatibla med mitten av – till high-throughput screening kampanjer. De mest använda analyserna omfatta receptor bindande experiment, fluorescens eller luminiscens baserat analyser att upptäcka variationer i nivån av så kallade sekundära budbärare (t.ex., Ca2 +, cykliskt adenosinmonofosfat (AMP)), fenotypiska screening-analyser och β-arrestin rekrytering analyser4. Valet för en viss typ av analys kan bero på flera faktorer, men bestäms även förkunskaper om signalering egenskaperna hos en given GPCR. Agonist bindning till en GPCR inducerar en conformationaländring som katalysera utbyte av guanidin diphosphate (BNP) för guanidin adenosintrifosfat (GTP) på den α-subenheten av heterotrimeric G proteiner. Därefter den Gα-GTP subuniten dissocierar från den Gβγ -subenheten och båda subunits kommer att initiera ytterligare signalvägar. Hydrolys av GTP-molekyl och efterföljande re sammanslutning av de Gα– BNP och Gβγ subenheter kommer att återställa den G-proteinet i dess inaktiva konformation5,6. Baserat på sekvens likheten mellan den Gα -subenheten definieras olika typer av G proteiner (GsGjagGq, G12/13)7. Signalering via den Gα subenhet ger upphov till flera typiska reaktioner såsom ökningen (via Gs) eller minskning (via Gjag) av cykliskt AMP produktion och intracellulära Ca2 + mobilisering (via Gq)5 ,7. Gβγ subenheter kan också inducera intracellulära effektor vägar. Exempelvis vid aktivering av Gjag-kopplat varandra, Gβγ kan direkt stimulera fosfolipas C (PLC-β) för att producera inositol trifosfat (IP-3) som utlöser frisättning av Ca2 + från intracellulära butiker7 . Efter aktivering av receptorn är varandra fosforyleras av GPCR kinaser (GRKs) som främjar interaktion med β-arrestins. Denna process avslutas G protein signalering och leder till receptorn desensibilisering och så småningom internalisering. Β-arrestins är också kan bilda flera molekylära komplex som kan utlösa andra signalvägar som är oberoende av G protein signalering8.
Inom underfamiljen av chemokine receptorer, den Gjag-kopplat CXCR4 är en GPCR som har väckt mycket intresse som lovande mål för läkemedelsutveckling. Tanke på dess etablerade roll som en större Co-receptorn för humant immunbristvirus 1 (HIV-1) utvecklades viral inträde och infektion, föreningar inriktning CXCR4 initialt som anti-HIV läkemedel kandidater9. Mer nyligen, en växande mängd bevis har pekat på en viktig roll för CXCR4 i uppkomst och cancer metastaser vilket gör det till en väl validerad terapeutiska mål i onkologi samt10. CXCR4 uttrycks mycket i mer än tjugo typer av mänskliga cancer och kontroller tumör cellöverlevnad, spridning, och migration samt tumör-relaterade angiogenes10. CXCR4 antagonister av olika kemiska klasser tidigare har beskrivit11,12, men endast små molekylen AMD3100 är för närvarande godkända för användning i kliniken som en agent för mobilisering av stamceller som används vid behandling av lymfom och myelom patienter13,14. Kliniska prövningar pågår för att utvärdera säkerhet och effekt av flera andra CXCR4 antagonister i olika mänskliga sjukdomar, men med ett starkt fokus på onkologi12. Med tanke på de många potentiella tillämpningar för CXCR4 antagonister, är sökandet efter nya föreningar med förbättrade farmakokinetiska egenskaper, förbättrad biotillgänglighet eller potentiellt mindre biverkningar befogad.
Häri, en kinetic fluorescens-baserade cellulära analysen används främst till skärmen för föreningar kan hämma CXCR4 beskrivs. Fluorescerande mätning av denna metod är baserad på den övergående ökningen av intracellulära Ca2 + koncentrationen frammanade vid CXCR4 aktivering av dess endogen agonist, chemokine liganden CXCL12 (tidigare känd som stromal cellen härlett faktor 1α ( SDF1-α)), och potentiella hämningen av detta CXCL12-inducerad Ca2 + svar av särskilda föreningar. I denna analys används U87 mänskliga glioblastoma celler stabilt uttrycker de mänskliga CXCR4-receptorn. Samtidigt saknar dessa celler endogena uttryck för CXCR7, en relaterad chemokine receptor som binder också CXCL1215,16,17. CXCR7 har tidigare också visat sig kunna bilda heterodimerer med CXCR4, därmed modulerande signalering egenskaperna för denna sistnämnda receptor18. Variationer i nivån av intracellulära Ca2 + medieras av CXCR4 övervakas av lastning CXCR4+ celler med fluo-2 acetoximetyl (AM) ester, en cell-permeable hög affinitet fluorescerande Ca2 +-bindande färgämne. Fluo-2 AM är en enda våglängd fluorescerande molekyl som kan vara upphetsad på 490 nm medan dess utsläpp fluorescens mäts vid 520 nm. Detta utsläpp fluorescens ökar vid Ca2 + bindning, med ett stort dynamiskt omfång mellan den Ca2 +-bundet och obundet staten. Ökningen av fluorescerande signal är övergående, som inträffar inom ett tidsintervall på några minuter, och kommer att sönderfalla efteråt. Topphöjd de fluorescerande utsläpp ytterligare korrelerar med nivån av receptor aktiveringen. Analysen själv utförs med hjälp av en fluorescens microplate reader utrustad med en intensifierad CCD (ICCD) kameran som besitter ett integrerat pipettering system som tillåter standardisering av pipettering stegen i analysen (se Tabell för material) . Samtidig mätning av fluorescerande signalen i alla brunnar i en mikroplattan är dessutom en annan viktig fördel med fluorescens läsaren som används. Under första delen av analysen föreningar under utredning (t.ex., en panel av små molekyler med en fast koncentration eller i en utspädning serie) läggs till fluo-2 AM laddad CXCR4+ U87 celler följt av en ~ 10 min inkubationstid under vilken den potentiella agonistiska effekten av föreningarna som mäts kontinuerligt i realtid. Sedan en endogen agonist (dvsCXCL12) läggs till cellerna för att framkalla en CXCR4-medierad övergående ökning av intracellulära Ca2 +. Under denna del av analysen kan den potentiella antagonistisk aktiviteten av de testa föreningarna utvärderas. En schematisk översikt över analysenss allmänna arbetsflödet presenteras i figur 1.
Även om denna Ca2 + mobilisering analys har främst använts för att identifiera och bestämma den hämmande potensen av konkurrenskraftiga CXCR4-antagonister (dvs, föreningar som förhindrar en endogen agonist för att binda och stimulera receptorn), det också kan identifiera receptoragonister och, dessutom, föreningar som utöva sin funktion genom bindning på Alloster platser (dvs, platser som topographically skiljer sig från orthosteric bindningsstället upptas av en endogen agonist). Allosteriska agonister och PAMs och NAMs19,20är exempel på den senare kategorin av föreningar. Medan receptor-specifika antagonister samt NAMs skulle hämma CXCL12-inducerad Ca2 + svaret, PAMs skulle förbättra detta svar (se även diskussionen avsnitt). Även om analysen beskrivs häri specifikt mål CXCR4, det förväntas att denna metod kan tillämpas på andra varandra med minimal optimering ansträngning, åtminstone om de signal via frisläppandet av intracellulära Ca2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den Ca2 +-mobilisering-analysen som beskrivs häri har tidigare visats vara ett värdefullt verktyg för att identifiera och karaktärisera-receptorantagonister inriktning CXCR417. Det förväntas dock att denna metod kan tillämpas mer allmänt till en stor grupp andra varandra som utlöser en cytosoliska Ca2 + release vid deras aktivering, som illustreras för relaterade chemokine receptorn CCR5. När det gäller CCR5 exakt samma experimentella villkor kunde tillämpas, kom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Eric Fonteyn och Geert Schoofs för utmärkt teknisk assistans. Detta arbete har stötts av den KU Leuven (bevilja nr. PF/10/018), den Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (CVE, bevilja nr. G.485.08), och den Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
References
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Fredriksson, R., Lagerstrom, M. C., Lundin, L. G., Schioth, H. B. The G-protein-coupled receptors in the human genome form five main families. Phylogenetic analysis, paralogon groups, and fingerprints. Mol Pharmacol. 63, 1256-1272 (2003).
- Lappano, R., Maggiolini, M. G protein-coupled receptors: novel targets for drug discovery in cancer. Nat Rev Drug Discov. 10, 47-60 (2011).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 33, 372-384 (2012).
- Milligan, G., Kostenis, E. Heterotrimeric G-proteins: a short history. Br J Pharmacol. 147, S46-S55 (2006).
- Tuteja, N. Signaling through G protein coupled receptors. Plant Signal Behav. 4, 942-947 (2009).
- Neves, S. R., Ram, P. T., Iyengar, R. G protein pathways. Science. 296, 1636-1639 (2002).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The beta-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. J Biol Chem. 291, 8969-8977 (2016).
- Zhang, H., et al. Discovery of non-peptide small molecular CXCR4 antagonists as anti-HIV agents: Recent advances and future opportunities. Eur J Med Chem. 114, 65-78 (2016).
- Chatterjee, S., Behnam Azad, B., Nimmagadda, S. The intricate role of CXCR4 in cancer. Adv Cancer Res. 124, 31-82 (2014).
- Debnath, B., Xu, S., Grande, F., Garofalo, A., Neamati, N. Small molecule inhibitors of CXCR4. Theranostics. 3, 47-75 (2013).
- Tsou, L. K., et al. Harnessing CXCR4 antagonists in stem cell mobilization, HIV infection, ischemic diseases, and oncology. Med Res Rev. , (2017).
- Keating, G. M. Plerixafor: a review of its use in stem-cell mobilization in patients with lymphoma or multiple myeloma. Drugs. 71, 1623-1647 (2011).
- DiPersio, J. F., et al. Phase III prospective randomized double-blind placebo-controlled trial of plerixafor plus granulocyte colony-stimulating factor compared with placebo plus granulocyte colony-stimulating factor for autologous stem-cell mobilization and transplantation for patients with non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 27, 4767-4773 (2009).
- Balabanian, K., et al. The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. J Biol Chem. 280, 35760-35766 (2005).
- Burns, J. M., et al. A novel chemokine receptor for SDF-1 and I-TAC involved in cell survival, cell adhesion, and tumor development. J Exp Med. 203, 2201-2213 (2006).
- Van Hout, A., D’Huys, T., Oeyen, M., Schols, D., Van Loy, T. Comparison of cell-based assays for the identification and evaluation of competitive CXCR4 inhibitors. PLoS One. 12, e0176057 (2017).
- Levoye, A., Balabanian, K., Baleux, F., Bachelerie, F., Lagane, B. CXCR7 heterodimerizes with CXCR4 and regulates CXCL12-mediated G protein signaling. Blood. 113, 6085-6093 (2009).
- Wootten, D., Christopoulos, A., Sexton, P. M. Emerging paradigms in GPCR allostery: implications for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 12, 630-644 (2013).
- Burford, N. T., Watson, J., Bertekap, R., Alt, A. Strategies for the identification of allosteric modulators of G-protein-coupled receptors. Biochem Pharmacol. 81, 691-702 (2011).
- Hendrix, C. W., et al. Safety, pharmacokinetics, and antiviral activity of AMD3100, a selective CXCR4 receptor inhibitor, in HIV-1 infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 37, 1253-1262 (2004).
- Schols, D., Este, J. A., Henson, G., De Clercq, E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4. Antiviral Res. 35, 147-156 (1997).
- Perry, C. M. Maraviroc: a review of its use in the management of CCR5-tropic HIV-1 infection. Drugs. 70, 1189-1213 (2010).
- Mehlin, C., Crittenden, C., Andreyka, J. No-wash dyes for calcium flux measurement. Biotechniques. 34, 164-166 (2003).
- Zhao, H., et al. CXCR4 over-expression and survival in cancer: a system review and meta-analysis. Oncotarget. 6, 5022-5040 (2015).
- De Clercq, E. The AMD3100 story: the path to the discovery of a stem cell mobilizer (Mozobil). Biochem Pharmacol. 77, 1655-1664 (2009).
- Milligan, G. Constitutive activity and inverse agonists of G protein-coupled receptors: a current perspective. Mol Pharmacol. 64, 1271-1276 (2003).
- Kenakin, T., Miller, L. J. Seven transmembrane receptors as shapeshifting proteins: the impact of allosteric modulation and functional selectivity on new drug discovery. Pharmacol Rev. 62, 265-304 (2010).
- Conn, P. J., Christopoulos, A., Lindsley, C. W. Allosteric modulators of GPCRs: a novel approach for the treatment of CNS disorders. Nat Rev Drug Discov. 8, 41-54 (2009).
- Burford, N. T., et al. Discovery of positive allosteric modulators and silent allosteric modulators of the mu-opioid receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10830-10835 (2013).
- Bartfai, T., Wang, M. W. Positive allosteric modulators to peptide GPCRs: a promising class of drugs. Acta Pharmacol Sin. 34, 880-885 (2013).
- Hatse, S., et al. Fluorescent CXCL12AF647 as a novel probe for nonradioactive CXCL12/CXCR4 cellular interaction studies. Cytometry A. 61, 178-188 (2004).
- Seifert, R., Wenzel-Seifert, K. Constitutive activity of G-protein-coupled receptors: cause of disease and common property of wild-type receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 366, 381-416 (2002).
- Zhang, W. B., et al. A point mutation that confers constitutive activity to CXCR4 reveals that T140 is an inverse agonist and that AMD3100 and ALX40-4C are weak partial agonists. J Biol Chem. 277, 24515-24521 (2002).
- Tamamura, H., et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140. Biochem Biophys Res Commun. 253, 877-882 (1998).
- Wang, Z. -. x., Neote, K., Letts, G. L., Moser, B., et al. . Chemokine Biology – Basic Research and Clinical Application: Volume II: Pathophysiology of Chemokines. , 61-77 (2007).
