Genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering
Summary
Translationel forordning spiller en vigtig rolle i kontrollen af protein overflod. Her, beskriver vi en høj overførselshastighed metode til kvantitativ analyse af oversættelse i spirende gær Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Oversættelse af mRNA i proteiner er en kompleks proces, der involverer flere lag af forordningen. Det antages ofte, at ændringer i mRNA transskription afspejler ændringer i proteinsyntesen, men mange undtagelser er blevet observeret. For nylig, en teknik kaldet ribosomet profilering (eller Ribo-Seq) fremstod som en kraftfuld metode, der giver mulighed for identifikation, med høj nøjagtighed, hvilke regioner af mRNA oversættes til proteiner og kvantificering af oversættelse på genom-plan. Vi præsenterer her, en generaliseret protokol for genome-wide kvantificering af oversættelse ved hjælp af Ribo-Seq i spirende gær. Desuden giver kombinere Ribo-Seq data med mRNA overflod målinger os samtidig kvantificere oversættelse effektivitet af tusindvis af mRNA udskrifter i samme prøve og sammenligne ændringer i disse parametre i svar til eksperimentelle manipulationer eller i forskellige fysiologiske stater. Vi beskriver en detaljeret protokol for generation af ribosomet fodspor ved hjælp af nukleasen fordøjelse, isolation af intakt ribosomet-fodaftryk komplekser via saccharose gradient fraktionering og forberedelse af DNA biblioteker til dyb sekvensering sammen med passende kvalitetskontrol er nødvendige for at sikre præcis analyse af i vivo oversættelse.
Introduction
mRNA oversættelse er en af de grundlæggende processer i cellen, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af protein udtryk. Derfor, mRNA oversættelse er stramt kontrolleret som svar på forskellige interne og eksterne fysiologiske stimuli 1,2. Mekanismer for Translationel forordning er dog stadig forsømt. Her beskriver vi protokol for genome-wide kvantificering af oversættelse i spirende gær af ribosomet profilering. Det overordnede mål med ribosomet profilering teknik er at studere og kvantificere oversættelse af specifikke mRNAs forskellige cellulære betingelser. Denne teknik bruger next generation sequencing kvantitativt analysere ribosomet belægning i hele genomet og giver mulighed for overvågning sats af protein syntese i vivo på enkelt codon opløsning 3,4. I øjeblikket, denne metode giver den mest avancerede metode til at måle niveauet af protein oversættelse, og har vist sig for at være en nyttig opdagelse værktøj giver oplysninger, der ikke kan blive afsløret af andre i øjeblikket tilgængelige teknik, fx microarrays eller oversættelse tilstand array analyse (TSAA) 5. Som ribosomet profilering rapporter om de samlede ændringer i udskrift niveauer og translationel output, giver det også meget større følsomhed i forhold til andre metoder.
Denne tilgang er baseret på dyb sekventering af ribosomet-beskyttet mRNA fragmenter 3. Under protein oversættelse, ribosomer beskytte ~ 28 nt dele af mRNA (kaldet fodspor) 6. Ved at bestemme rækkefølgen af ribosomet-beskyttet fragmenter, kan Ribo-Seq kortlægge placeringen af ribosomer på den oversatte mRNA og identificere hvilke regioner af mRNA er tilbøjelige til at være aktivt oversat til protein 3,7. Desuden måler vi kvantitativt oversættelse af mRNA ved at tælle antallet af fodspor, der justeres i forhold til en given mRNA udskrift.
For at isolere de ribosom-beskyttet fragmenter, behandles cellelysater i første omgang med en oversættelse hæmmer til stall ribosomer efterfulgt af ribonuklease fordøjelsen. Der henviser til, at frie mRNA og dele af oversatte mRNAs ikke beskyttet af ribosomes er nedbrudt af ribonuklease, kan ribosomet-beskyttet mRNA fragmenter inddrives ved rensende intakt ribosomet-fodaftryk komplekser. Disse mRNA fodspor er derefter omdannes til cDNA bibliotek og analyseret af dyb sekventering (figur 1). Parallelt til ribosomet profilering er intakt mRNA udvundet fra den samme prøve og sekventeret. Ved at sammenligne niveauet for oversættelse identificeret ved Ribo-Seq med mRNA overflod målinger, kan vi identificere gener, der er specifikt op – eller nedreguleret på niveau med oversættelse og beregne oversættelse effektivitet af mRNA på genom-plan. Mens den protokol, der er beskrevet i denne artikel er specifikke for gær, bør det også være nyttig for forskere, der vil forsøge at etablere Ribo-Seq-protokollen i andre systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ribo-Seq tilgang har vist sig som en kraftfuld teknologi til analyse af mRNA oversættelse i vivo på genome-wide niveau 3. Undersøgelser ved hjælp af denne fremgangsmåde, der tillader overvågning oversættelse med single-codon opløsning, har bidraget til forståelsen af translationel forordning. Trods sine fordele har Ribo-Seq flere begrænsninger. Ribosomale RNA (rRNA) fragmenter er altid Co renset under isolation af ribosomet-beskyttet fodspor faldende udbytte af nyttige sekventer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af de nationale kontorer i sundhed tilskud AG040191 og AG054566 til VML. Denne forskning blev udført mens VML var en AFAR forskning tilskud modtager fra den amerikanske sammenslutning for aldring forskning.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
