הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום
Summary
תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.
Abstract
תרגום של mRNA לחלבונים הוא תהליך מורכב מעורבים בכמה שכבות של רגולציה. לעיתים קרובות ההנחה כי השינויים בתעתיק mRNA לשקף שינויים בסינתזה של חלבון, אך נצפו חריגות רבות. לאחרונה, טכניקה שנקראת פרופיל הריבוזום (או Ribo-Seq) התפתחה שיטה רב עוצמה המאפשר זיהוי, עם רמת דיוק גבוהה, באילו אזורים של mRNA מתורגמים חלבונים, כימות של תרגום ברמת הגנום כולו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מוכללת על הגנום כולו כימות של תרגום באמצעות Ribo-Seq ניצני שמרים. בנוסף, שילוב של Ribo-Seq נתונים עם מדידות שפע mRNA מאפשר לנו בו זמנית לכמת יעילות התרגום של אלפי mRNA תעתיקים במדגם זהה ולהשוות בין שינויים בפרמטרים האלה בתגובה ניסיוני מניפולציות או במצבים פיזיולוגיים שונים. אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור הדור של ריבוזום עקבות שימוש נוקלאז עיכול, בידוד של הריבוזום שלם-טביעת מתחמי ויה fractionation הדרגתיות סוכרוז, והכנה של ספריות DNA רצף עמוק יחד עם המתאים פקדים איכות הדרושים כדי להבטיח ניתוח מדויק של תרגום ויוו .
Introduction
תרגום ה-mRNA הוא אחד התהליכים הבסיסיים בתא, אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי חלבון. לפיכך, תרגום mRNA מפוקחת בתגובה לגירויים פיזיולוגיים שונים פנימיים וחיצוניים 1,2. עם זאת, מנגנוני רגולציה translational נשארים understudied. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור כימות ברמת הגנום של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום. המטרה הכוללת של ריבוזום פרופיל הטכניקה היא ללמוד ולכמת את התרגום של mRNAs ספציפיים בתנאים שונים הסלולר. שיטה זו משתמשת הדור הבא רצפי לנתח באופן כמותי את הריבוזום תפוסה ברחבי הגנום ומאפשרת ניטור הקצב של חלבון סינתזה ויוו codon יחיד ברזולוציה 3,4. כיום, בשיטה זו מספק את האמצעים המתקדמים ביותר למדוד את הרמות של תרגום החלבון, הוכיחה להיות כלי גילוי שימושי להצגת מידע אשר אינם יכולים להתגלות על ידי טכניקות אחרות הזמינות כעת, למשל מיקרו-מערכים או תרגום המדינה מערך ניתוח (TSAA) 5. כמו הריבוזום פרופיל דוחות על שינויים בשילוב רמות התעתיק והפלט translational, הוא גם מספק הרבה רגישות לעומת שיטות אחרות.
גישה זו מבוססת על רצף עמוק של המוגנים ריבוזום mRNA שברי 3. במהלך תרגום החלבון, ריבוזומים להגן על ~ 28 חלקים nt של mRNA (הנקרא עקבות) 6. על-ידי קביעת הרצף של השברים המוגנים ריבוזום, Ribo-Seq ניתן למפות את המיקום של הריבוזומים על mRNA מתורגם, לזהות באילו אזורים של mRNA נוטים להיות מתורגם באופן פעיל חלבון 3,7. בנוסף, אנו יכולים באופן כמותי למדוד את התרגום של mRNA על-ידי ספירת מספר עקבות, ליישר תעתיק mRNA נתון.
על מנת לבודד את השברים המוגנים ריבוזום, lysates תא מטופלים בתחילה עם מעכב תרגום לעכב הריבוזומים ואחריו ribonuclease לעיכול. ואילו mRNA וחופשית חלקים מתורגם mRNAs אינו מוגן על ידי הריבוזומים הם נפגמים בשל ribonuclease, ניתן לשחזר השברים mRNA המוגנים ריבוזום וטיהור מתחמי הריבוזום שלם-טביעת רגל. עקבות אלה mRNA שהוסב ספריית cDNA, ואז נותחו על ידי רצף עמוק (איור 1). במקביל ריבוזום פרופיל, שלם mRNA המופק באותה דגימת זרע, וסודרו. על ידי השוואת רמת התרגום המזוהה על-ידי Ribo-Seq עם מדידות שפע mRNA, אנו יכולים לזהות גנים הנמצאים במפורש למעלה או למטה-מוסדר ברמה של תרגום, לחשב יעילות התרגום של mRNA ברמת הגנום כולו. בעוד הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא ספציפי שמרים, זה צריך להיות גם שימושי עבור חוקרים מי ינסה ליצור פרוטוקול Ribo-Seq במערכות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגישה Ribo-Seq התפתחה טכנולוגיה רבת עוצמה לניתוח של mRNA תרגום ויוו הגנום כולו ברמה 3. מחקרים באמצעות גישה זו, אשר מאפשר ניטור תרגום עם רזולוציה יחיד-codon, תרם להבנת translational רגולציה. למרות יתרונותיה, Ribo-Seq יש מספר מגבלות. שברי Ribosomal RNA (rRNA) הם תמיד מטוהרים במשותף במהלך בידוד עקבות המו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AG040191 ו- AG054566 כדי VML. מחקר זה נערך בזמן VML היה נמען מענק מחקר עפר מן הפדרציה האמריקאית לחקר הזדקנות.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
