Summary

Genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering

Published: December 21, 2017
doi:

Summary

Translationeel verordening speelt een belangrijke rol in de controle van eiwitten overvloed. Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor de kwantitatieve analyse van vertaling in de ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Vertaling van mRNA in eiwitten is een complex proces waarbij verschillende lagen van de verordening. Er wordt vaak verondersteld dat wijzigingen in de transcriptie van mRNA in de eiwitsynthese wijzigingen, maar veel uitzonderingen zijn waargenomen. Onlangs, een techniek genaamd ribosoom profiling (of Ribo-Seq) heeft ontpopt als een krachtige methode waarmee identificatie, met een hoge nauwkeurigheid, welke regio’s van mRNA worden omgezet in eiwitten en kwantificering van de vertaling op de genoom-brede niveau. Hier presenteren we een gegeneraliseerde protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling Ribo-Seq met ontluikende gist. Daarnaast kan Ribo-Seq gegevens combineren met mRNA overvloed metingen we tegelijkertijd kwantificeren vertaling efficiëntie van duizenden mRNA afschriften in hetzelfde monster en wijzigingen in deze parameters in reactie op experimentele vergelijken manipulaties of in verschillende fysiologische staten. Beschrijven we een gedetailleerd protocol voor generatie van ribosoom footprints nuclease spijsvertering, isolatie van intact ribosoom-voetafdruk complexen via sacharose kleurovergang fractionering en voorbereiding van DNA bibliotheken gebruiken voor het diepe rangschikken samen met passende kwaliteitscontroles nodig om ervoor te zorgen nauwkeurige analyse van in vivo vertaling.

Introduction

vertaling van mRNA is een van de fundamentele processen in de cel, die een belangrijke rol in de regulatie van eiwit expressie speelt. Vertaling van mRNA is daarom streng gecontroleerd in reactie op verschillende interne en externe fysiologische stimuli 1,2. De mechanismen van translationeel verordening blijven echter understudied. Hier beschrijven we het protocol voor genoom-brede kwantificering van vertaling in de ontluikende gist door het ribosoom profilering. Het algemene doel van het ribosoom profiling techniek is om te studeren en kwantificeren van de vertaling van specifieke mRNAs onder verschillende cellulaire omstandigheden. Deze techniek maakt gebruik van volgende-generatie sequencing kwantitatief ribosoom bezetting gedurende het genoom te analyseren en zorgt voor de opvolging van het tempo van de eiwit synthese in vivo aan de enkel codon resolutie 3,4. Op dit moment deze methode biedt de meest geavanceerde middelen voor het meten van de hoeveelheid eiwit vertaling, en heeft bewezen te zijn een nuttige ontdekkingshulpmiddel verstrekken van informatie die door andere momenteel beschikbare technieken, bijvoorbeeld microarrays kan niet worden onthuld of vertaling staat matrix analyse (TSAA) 5. Als ribosoom profilering van de verslagen over de gecombineerde wijzigingen in afschrift niveaus en eindmaterialen zijn translationeel, biedt het ook veel grotere gevoeligheid ten opzichte van andere methoden.

Deze aanpak is gebaseerd op diep sequentiebepaling van ribosoom beveiligd mRNA fragmenten 3. Tijdens de eiwit vertaling, ribosomen beschermen ~ 28 nt gedeelten van de mRNA (genaamd voetafdrukken) 6. Door het bepalen van de volgorde van de fragmenten ribosoom-beschermd, kan Ribo-Seq betreffendedepositie van ribosomen op het vertaalde mRNA in kaart en bepalen welke gebieden van mRNA zijn waarschijnlijk actief in eiwit 3,7worden omgezet. Daarnaast kunnen we de vertaling van mRNA kwantitatief meten door het tellen van het aantal voetafdrukken die zijn afgestemd op een bepaalde transcriptie van mRNA.

Om te isoleren van het ribosoom beveiligd fragmenten, worden cel lysates in eerste instantie behandeld met een vertaling-remmer tot stilstand van de ribosomen gevolgd door ribonuclease spijsvertering. Overwegende dat vrije mRNA en delen van vertaalde mRNAs niet beschermd door de ribosomen zijn afgebroken door ribonuclease, kunnen het ribosoom beveiligd mRNA fragmenten worden hersteld door het zuiveren van intact ribosoom-voetafdruk complexen. Deze mRNA voetafdrukken worden vervolgens omgezet in cDNA Bibliotheek en geanalyseerd door diepe sequentiebepaling (Figuur 1). Parallel aan het ribosoom profilering, is intact mRNA geëxtraheerd uit hetzelfde monster en sequenced. Door het vergelijken van het niveau van de vertaling geïdentificeerd door Ribo-Seq met mRNA overvloed metingen, kunnen we identificeren van genen die specifiek up – of down-geregeld op het niveau van de vertaling en berekenen van de efficiëntie van de vertaling van mRNA op het genoom-brede niveau. Terwijl het protocol beschreven in dit artikel specifiek voor gist is, zou het ook nuttig zijn voor onderzoekers die proberen zal om het Ribo-Seq-protocol in andere systemen.

Protocol

1. de voorbereiding van het uittreksel Streak giststammen uit bevroren voorraden voor enkele kolonies op YPD platen (gistextract 1%, 2% pepton, glucose van 2% en 2% agar). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 dagen. Inoculeer gist uit een plaat van de YPD (gebruik een één kolonie) in 15 mL YPD medium (gistextract 1%, 2% pepton, 2% glucose) in een tube van 50 mL conische centrifuge en ‘s nachts groeien met schudden (200-250 rpm) bij 30 ° C. Cultuur in 500 mL voor YPD medium in een …

Representative Results

Gedetailleerde pijpleidingen voor bioinformatic analyse van data profiling ribosoom geweest eerder 8,9beschreven. Verschillende onderzoeksgroepen hebben voorts bioinformatica tools voor differentiële gen expressie analyse en verwerking van gegevens van reeksnummers, die specifiek zijn voor ribosoom profilering methode 10,11,12 ,</s…

Discussion

De Ribo-Seq-aanpak heeft ontpopt als een krachtige technologie voor de analyse van mRNA vertaling in vivo aan de genoom-brede niveau 3. Studies met deze aanpak, die zorgt voor de opvolging van de vertaling met single-codon resolutie, heeft bijgedragen aan ons begrip van translationeel verordening. Ondanks zijn voordelen heeft Ribo-Seq verscheidene beperkingen. Ribosomaal RNA (rRNA) fragmenten zijn altijd mede gezuiverde tijdens Isolatievan ribosoom beveiligd voetafdrukken minderen van de …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health grants AG040191 en AG054566 naar VML. Dit onderzoek werd uitgevoerd terwijl VML een onderzoeksbeurs van de AFAR-ontvanger van de Amerikaanse Federatie voor veroudering onderzoek was.

Materials

0.45 μM membrane filters Millipore HVLP04700
0.5 M EDTA Invitrogen AM9261
0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) Millipore UFC510024
1 M Tris-HCl, pH 7.0 Invitrogen AM9850G
1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) Invitrogen 15567-027
10X TBE buffer Invitrogen AM9863
10% TBE-urea gel Invitrogen EC6875BOX
15% TBE-urea gel Invitrogen EC6885BOX
2 M MgCl2 RPI M24500-10.0
2X TBE-urea sample buffer Invitrogen LC6876
3M NaOAc, pH 5.5 Invitrogen AM9740
5' Deadenylase (10 U/μL) Epicentre DA11101K
5X Nucleic acid sample loading buffer Bio-Rad 161-0767
8% TBE gel Invitrogen EC6215BOX
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) Invitrogen AM9722
Blue light transilluminator Clare Chemical Research DR-46B
Chrome-steel beads, 3.2 mm BioSpec Products 11079132c
Cryogrinder Biospec product 3110BX
Cycloheximide RPI C81040-5.0
Data Acquisition System DATAQ Instruments DI-245
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) NEB N0447L
Glycogen Invitrogen AM9510
Gradient fractionation system Brandel BR-184X
High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) NEB M0530S Supplied with 5X Phusion HF Buffer
Next-generation sequencing library quantification kit Kapa Biosystems KK4824
Nucleic acid gel stain Invitrogen S11494
Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Poly(A) mRNA isolation kit Invitrogen 61011
Rec J exonuclease (10 U/μL) Epicentre RJ411250
Reverse transcriptase (200 U/μL) Invitrogen 18080093 Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT
RNA fragmentation buffer NEB E6186A
RNase I (100 U/μL) Invitrogen AM2295
RNase inhibitor (20 U/μL) Invitrogen AM2696
Silicone rubber caps BioSpec Products 2008
ssDNA ligase (100 U/μL) Epicentre CL9021K Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2
Stainless steel microvials, 1.8 mL BioSpec Products 2007
Sucrose RPI S24060-5000.0
SW-41 Ti rotor Beckman Coulter 331362
Syringe pump New Era Pump Systems NE-300
T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) NEB M0201S Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer
T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) NEB M0373S Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000
Thermal cycler Bio-Rad 1851148
Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL Beckman Coulter 331372
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML
UV monitor Bio-Rad 7318160
Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 Open Biosystems YSC1048

References

  1. Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
  2. Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
  3. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  4. Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
  5. Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
  6. Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
  7. Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
  8. Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
  9. Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
  10. Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
  11. Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
  12. Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
  13. Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
  14. Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
  15. Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
  16. Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
  17. Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
  18. Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  21. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
  22. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  23. van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
  24. Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
  25. Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
  26. Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
  27. Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
  28. Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
  29. Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
  30. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
  31. Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
  32. O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).

Play Video

Cite This Article
Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling. J. Vis. Exp. (130), e56820, doi:10.3791/56820 (2017).

View Video