Genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering
Summary
Translasjonsforskning regulering spiller en viktig rolle i kontrollen av protein overflod. Her beskriver vi en høy gjennomstrømming metode for kvantitativ analyse av oversettelse i spirende gjær Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Oversettelse av mRNA til proteiner er en kompleks prosess som involverer flere lag av regulering. Det er ofte antatt at endringer i mRNA transkripsjon gjenspeile endringer i proteinsyntese, men mange unntak er observert. Nylig en teknikk kalt ribosom profilering (eller Ribo-Seq) har dukket opp som en kraftfull metode som tillater identifikasjon, med høy nøyaktighet, hvilke områder av mRNA er oversatt til proteiner og kvantifisering av oversettelse på genomet hele nivå. Her presenterer vi en generalisert protokoll for genomet hele kvantifisering av oversettelse med Ribo-Seq i spirende gjær. I tillegg tillater kombinerer Ribo-Seq data med mRNA overflod målinger oss å kvantifisere samtidig oversettelse effektivitet av mRNA utskrifter i samme utvalget og sammenligne endringer i disse parameterne svar på eksperimentell manipulasjoner eller i forskjellige fysiologiske stater. Vi beskriver en detaljert protokoll for generering av ribosom fotavtrykk bruker nuclease fordøyelsen, isolasjon av intakt ribosom-fotavtrykk komplekser via sukrose gradient fraksjoneres og utarbeidelse av DNA biblioteker for dyp sekvensering med riktig kvalitetskontroll er nødvendig for å sikre nøyaktig analyse av i vivo oversettelse.
Introduction
mRNA oversettelse er en grunnleggende prosesser i cellen, som spiller en viktig rolle i regulering av protein uttrykk. Derfor er mRNA oversettelse strengt kontrollert svar til ulike interne og eksterne fysiologiske stimuli 1,2. Imidlertid fortsatt mekanismer av translasjonsforskning regulering lite studert. Her beskriver vi protokollen for genomet hele kvantifisering av oversettelse i spirende gjær av ribosom profilering. Det overordnede målet med ribosom profilering teknikken er å studere og kvantifisere oversettelsen av bestemte mRNAs under ulike mobilnettet forhold. Denne teknikken bruker neste generasjons sekvensering kvantitativt analysere ribosom innkvartering i genomet og tillater overvåking frekvensen av protein syntese i vivo på enkelt codon oppløsning 3,4. Foreløpig denne metoden er den mest avanserte å måle nivåene av protein oversettelsen, og har vist seg for å være et nyttig funn verktøy informasjon som ikke kan avsløres av andre tilgjengelige teknikker, f.eks microarrays eller oversettelse staten matrise analyse (TSAA) 5. Som ribosom profilering rapporter om kombinerte endringene i transkripsjon nivåer og translasjonsforskning utgang, gir det også mye større sensitivitet sammenliknet med andre metoder.
Denne tilnærmingen er basert på dyp sekvensering av ribosom-beskyttet mRNA fragmenter 3. Under oversettelsen er protein, ribosomer beskytte ~ 28 nt deler av mRNA (kalt fotavtrykk) 6. Ved å bestemme rekkefølgen av ribosom-beskyttet fragmenter, kan Ribo-Seq tilordne plasseringen av ribosomer på den oversatte mRNA og identifisere hvilke områder av mRNA er sannsynlig å bli aktivt oversatt til protein 3,7. I tillegg kan vi kvantitativt mål oversettelsen av mRNA ved å telle antall fotavtrykk som sammenfaller med en gitt mRNA transkripsjon.
For å isolere ribosom-beskyttet fragmenter, behandlet celle lysates først med en oversettelse hemmer båsen ribosomene etterfulgt av ribonuclease fordøyelsen. Mens gratis mRNA og deler av oversatt mRNAs ikke beskyttet av ribosomer er degradert av ribonuclease, gjenopprettes ribosom-beskyttet mRNA fragmenter av rensing intakt ribosom-fotavtrykk komplekser. Disse mRNA fotavtrykk deretter konvertert til cDNA bibliotek og analyseres av dyp sekvensering (figur 1). Parallelt med ribosom profilering, er intakt mRNA Hentet fra samme prøven og sekvensielt. Ved å sammenligne nivået av oversettelse identifisert av Ribo-Seq med mRNA overflod målinger, kan vi identifisere gener som er spesielt opp – eller ned-regulert på nivå med oversettelse og beregne oversettelse effektivitet av mRNA på genomet hele nivå. Mens beskrevet i denne artikkelen er spesifikke for gjær bør det være også nyttig for forskerne som vil prøve å etablere Ribo-Seq protokollen i andre systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ribo-Seq tilnærmingen har dukket opp som en kraftig teknologi for analyse av mRNA oversettelse i vivo på genomet hele nivå 3. Studier med denne tilnærmingen, som tillater avlytting oversettelse med enkelt-codon oppløsning, har bidratt til vår forståelse av translasjonsforskning regulering. Til tross for sine fordeler har Ribo-Seq flere begrensninger. Ribosomal RNA (rRNA) fragmenter er alltid co renset under isolasjon av ribosom-beskyttet fotavtrykk redusere avkastningen av nyttig s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir AG040191 og AG054566 til VML. Denne forskningen ble utført mens VML var en AFAR forskningsstipend mottaker fra American Federation for aldring forskning.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
