Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Virale transkriptionelle Fabriken sind diskrete Strukturen, die mit zellulären RNA-Polymerase II, virale Gentranskription bei Reaktivierung erhöhen angereichert sind. Hier ist eine Methode, um Seiten der Transkription aktiv viral Chromatin im 3D-Raum nuklearen durch eine Kombination von Immunfluoreszenz-Färbung und in Situ -RNA-Hybridisierung zu finden.
Abstract
Es ist bekannt, dass räumliche und zeitliche Regelung der Gene Bestandteil ist des Regierens richtige Genexpression. Daher ist es von unschätzbarem Wert zu verstehen, wo und wann Transkription in nuklearen Raum stattfindet und die Beziehung zwischen Episomes innerhalb der gleichen Zellkern infiziert zu visualisieren. Hier, Immunfluoreszenz (IFA) und RNA-Fische wurden Combinedto identifizieren aktiv Transkription Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) Episomes. Durch Färbung KSHV Latenz-assoziierten nuclear Antigen (LANA), ist es möglich, zu finden, wo virale Episomes im Zellkern vorhanden. Darüber hinaus können durch die Gestaltung von RNA-FISH-Sonden, um der Intron-Region eines viralen Gens zu Zielen, die nur während der produktiven Infektion ausgedrückt wird, im Entstehen begriffenen RNA-Transkripte befinden. Mit dieser Kombination aus molekularen Sonden, ist es möglich, die Montage von großen virale Transkription Fabriken visualisieren und analysieren die räumlichen Regulierung der viralen Genexpression während KSHV Reaktivierung. Durch die Einbeziehung Anti-RNA-Polymerase II Antikörper Färbung, kann man auch die Assoziation zwischen RNA-Polymerase II (RNAPII)-Aggregation und KSHV Transkription bei Reaktivierung sichtbar machen.
Introduction
Es ist immer deutlicher geworden, dass die räumlich-zeitliche Organisation des Kerns eine wichtige Rolle spielt bei der Modulation der fein abgestimmten Genexpression in den Eukaryotes. Die meisten Gewebe spezifische Gene über viele Chromosomen verteilt sind und synchron geregelt werden, um auf bestimmte Reize in einer koordinierten Art und Weise1reagieren müssen. Zellen bauen aktiv Chromatin Naben (ACH) als eine Möglichkeit der Zusammenführung von Genen und deren Cis-regulatorische Komponenten auf einem bestimmten nuklearen Raum1.
Es wurde auch durch verschiedene Studien nachgewiesen, dass obwohl der Kern sehr dicht und Viskose scheint, biologisch aktive Molekülen Nucleus ziemlich schnell per Diffusion2durchlaufen können. Als Folge dieser ephemeren Eigenschaft springen”” die meisten DNA-bindende Proteine von verbindlichen Website Website, Gefühl, ihren Weg um die nuklearen Raum, ermöglicht eine sehr anpassungsfähige und vielseitige Kern2als verbindlich.
Trotz dieses dynamische Verhalten von Biomolekülen innerhalb des Zellkerns, nukleare Einrichtungen ohne Membranen wie z. B. (aber nicht beschränkt auf) die Nukleolus, Cajal Körper und Promyelocytic Leukämie nuklearen Einrichtungen (PML-NB) noch vorhanden sind. Es ist durch eine Vielzahl von Mechanismen wie DNA Tandemwiederholungen (Nukleolus), rRNA (Nukleolus) und Strukturproteinen wie coilin (Cajal Bodies) oder PML Proteine (PML-NB), die diese Konstrukte zusammen3,4,5 halten . Diese Strukturen und anderen Gemeinden wie Transkription Fabriken dienen als Gerüste, die erhöhen nicht nur die lokale Konzentration von erforderlichen Komponenten, sondern Regeln auch die Zusammensetzung von Proteinen und Nukleinsäuren in ihnen letztendlich schaffen eine zentraler Standort für effiziente Zellfunktionen6.
Wann und wo atomare Strukturen Form bietet eine Fülle von Informationen für Forscher studieren Epigenetik zu visualisieren. Aus Sicht der Virologie der Reaktivierung der latent infizierten Viren, z. B. KSHV, erheblich verändert die Landschaft des Kerns und Verteilung der nuklearen Enzyme, Transkription in erster Linie aus zellulären Genen auf virale Gene, letztlich zu verlagern, voll funktionsfähige virale Nachkommen7,8zu produzieren. Wie manipuliert KSHV zelluläre gen Ausdruck Maschinen, virale Genexpression zu erleichtern? Solche Informationen könnten auch Aufschluss über zeitliche zelluläre gen Regulationsmechanismen.
Wie alle anderen Herpesviren hat KSHV zwei Lebenszyklen lytischen Replikation und Latenz genannt. KSHV befindet sich in erster Linie in der Latenz-Phase, in der die meisten seiner viralen Gens Ausdruck zum Schweigen gebracht wird, außer Latenz Gene9,10verbunden. Während der Wartezeit, die KSHV produziert verbundene Latenz nuclear Antigen (LANA), die konstitutiv bindet das virale Genom und Anbindehaltung virale Chromatin der menschlichen Chromosom11. Wegen Lanas intime Beziehung mit das virale Genom ist es möglich, IFA und DAPI zu färben und zu lokalisieren, wo der viralen Episomes in Bezug auf die Host-Chromatin waren zu verwenden.
Um KSHV Reaktivierung auf der Ebene der einzelnen Episome und die Assoziation mit anderen viralen Episomes in einer infizierten Zelle zu untersuchen, wurde eine Strategie suchen aktiv Transkription viraler Chromatin in Situ gegründet. Dementsprechend wurden LANA und RNAPII IFA mit Intron-RNA-Fisch kombiniert, durch die Generierung von RNA-FISH-Sonden, die an der Intron-Region (genaue Sonde finden Sie Sequenzen in die Izumiya Lab neueste Veröffentlichung8) binden KSHV K-Rta-die wichtigsten virales Protein, das ist, notwendig und ausreichend für KSHV Reaktivierung-es möglich war, wo Transkription tatsächlich nahm Platz8,11,12,13,14,15 . Diese Intron-RNA-FISH-Technik ermöglicht Forschern zu visualisieren, wo mRNA transkribiert ist, sofort bevor es gespleißt und, Zytoplasma16,17 exportiert.
KSHV kann reaktiviert werden, durch verschiedene chemische Reize, einschließlich Phorbol Ester wie 12-O-Tetradeconoyl-Phorbol-13acetate (TPA) und Histon-Deacetylase-Hemmer wie Natrium Butyrat, zusätzlich KSHV durch Überexpression von reaktivieren induziert werden können die virale Transkriptionsfaktor, K-Rta-19. Forscher haben erfolgreich erhöht die Effizienz der KSHV Reaktivierung durch die Synchronisation der Zelle Zyklen vor Induktion Reaktivierung18. So wurden für diese Spezialuntersuchungen Zellen synchronisiert, mit einen doppelten Thymidin-Block (Protokoll beschrieben) und für eine kurze Zeit mit TPA und Doxycyclin (Dox) inkubiert. Doxycyline wurde verwendet, weil in diesen Experimenten verwendeten Zelllinie eine Doxycyclin-induzierbaren K-Rta-Kassette, die wurde von cDNA kloniert und beinhaltet nicht die Intron-Region von K-Rta hat. Es ist zwar möglich, reaktivieren KSHV mit K-Rta Ausdruck nur induziert, es ist von anderen Forschern nachgewiesen worden, dass aufgrund einer Vielzahl von verschiedenen biochemischen Faktoren K-Rta Ausdruck allein erweist sich als ein schwacher Reaktivierung Reize20. Durch die Kombination aller dieser, und durch die Droge Inkubationen für einen kurzen Zeitraum zu begrenzen wurde eine robuste, aber nicht übermäßig künstliche KSHV Reaktivierung für die Bildgebung erreicht.
Nach LANA, RNAPII, Kennzeichnung K-Rta Introns und DNA als in diesem Dokument beschriebenen, 3D Fluoreszenz-Bildgebung erfolgte mittels einer Weitfeld Dekonvolution Mikroskop. Nach der Bearbeitung mit imaging-Software kann die räumliche Verteilung der aktiven viralen Episomes richtig ausgewertet werden. Mit dieser Technik können die zentralen Fragen über die grundlegende Natur der Bildung von aktiven Chromatin Hubs und andere atomaren Strukturen untersucht werden. Mit identischen virale Episomes in eine einzelne Zelle, die die gleichen regulatorischen Elemente verarbeitet kann eine einzigartige Recherche-Tool zur Vertiefung des Verständnisses der raumzeitlichen gen Regulationsmechanismen darstellen.
Eine Einschränkung von imaging-mehrere Zelle Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten fixiert um eine von Natur aus molekularen Dynamik zu charakterisieren ist, dass subtile oder kleine Änderungen bei Fluoreszenz Verteilung unentdeckt oder als unbedeutend. Dies gilt, sofern in dem seltenen Fall, jede Zelle beobachtet die gleiche subtile Änderung zeigt. Daher kann nicht die volle raumzeitliche Beziehung aktive virale Transkription und anderen atomaren Strukturen mit festen Bildgebung kritisch beurteilt werden. Um diese technischen Herausforderungen zu begegnen, ist der beste Ansatz, Bild lebenden Zellen, die virale Episomes geprägt haben und die Lage der wichtigsten zellulären Enzymen im Laufe der Zeit folgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt einige Aspekte des Protokolls, die geändert werden können, um außergewöhnliche Umstände zu berücksichtigen. Die Wahl der Fixierung und Permeabilisierung Puffer kann auch geändert werden. Für Fixierung Puffer Paraformaldehyd ist auch wirksam und Ethanol für Permeabilisierung genutzt werden.
Abschrecken von Formaldehyd mit Glycin, die PBS empfohlen wird, da es verhindert, dass Formaldehyd deaktivieren die Antikörper in Abwesenheit von Rinderserumalbumin (BSA), aber wenn die Dec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die National Institutes of Health Grant (R01-DE025985) und durch eine amerikanische Krebs Gesellschaft Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch Zuschüsse aus dem US Department of Agriculture (2015-67015-23268 und 2014-67015-21787) und neue Research Initiative Grant University of California, Davis.
Materials
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco by Life Technologies | 61870-036 | Needs to be warmed to 37 °C |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco by Life Technologies | 10378-016 | |
| Thymidine | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Solution | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosive, toxic, health hazard |
| Diethyl Pyrocarbonate | Sigma Aldrich | D-5758 | Acute toxicity |
| Glycine | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | Flammable, toxic |
| Methanol | Fisher Chemical | 67-56-1 | Flammable, toxic, health hazard |
| Rat monoclonal antibody to KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| Anti-RNA Polymerase II Antibody clone CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ribonucleic acid, transfer from baker’s yeast (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Saline sodium citrate buffer 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | 15557044 | |
| Formamide | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Dextran Sulfate, 50% solution | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4’,6-diamindino-2-phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold antifade reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cover glass 22×22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | 3D imaging software | ||
| DeltaVision microscope | |||
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
References
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291 (5505), 843-847 (2001).
- Bernardi, R., Pandolfi, P. P. Structure, dynamics and functions of promyelocytic leukaemia nuclear bodies. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 1006-1016 (2007).
- Cioce, M., Lamond, A. I. Cajal bodies: a long history of discovery. Annu Rev Cell Dev Biol. 21, 105-131 (2005).
- Boisvert, F. M., van Koningsbruggen, S., Navascues, J., Lamond, A. I. The multifunctional nucleolus. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (7), 574-585 (2007).
- Sutherland, H., Bickmore, W. A. Transcription factories: gene expression in unions. Nat Rev Genet. 10 (7), 457-466 (2009).
- Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. DNA virus replication compartments. J Virol. 88 (3), 1404-1420 (2014).
- Chen, C. P., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Hijacks RNA Polymerase II To Create a Viral Transcriptional Factory. J Virol. 91 (11), (2017).
- Ganem, D. KSHV and the pathogenesis of Kaposi sarcoma: listening to human biology and medicine. J Clin Invest. 120 (4), 939-949 (2010).
- Mesri, E. A., Cesarman, E., Boshoff, C. Kaposi’s sarcoma and its associated herpesvirus. Nat Rev Cancer. 10 (10), 707-719 (2010).
- Campbell, M., et al. Protein arginine methyltransferase 1-directed methylation of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus latency-associated nuclear antigen. J Biol Chem. 287 (8), 5806-5818 (2012).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
- Darst, R. P., Haecker, I., Pardo, C. E., Renne, R., Kladde, M. P. Epigenetic diversity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2993-3009 (2013).
- Osborne, C. S., et al. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by Igh. PLoS Biol. 5 (8), 192 (2007).
- Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes. Cell. 155 (3), 606-620 (2013).
- Borah, S., Darricarrere, N., Darnell, A., Myoung, J., Steitz, J. A. A viral nuclear noncoding RNA binds re-localized poly(A) binding protein and is required for late KSHV gene expression. PLoS Pathog. 7 (10), 1002300 (2011).
- Chang, P. C., et al. Histone demethylase JMJD2A regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus replication and is targeted by a viral transcriptional factor. J Virol. 85 (7), 3283-3293 (2011).
- McAllister, S. C., Hansen, S. G., Messaoudi, I., Nikolich-Zugich, J., Moses, A. V. Increased efficiency of phorbol ester-induced lytic reactivation of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus during S phase. J Virol. 79 (4), 2626-2630 (2005).
- Miller, G., El-Guindy, A., Countryman, J., Ye, J., Gradoville, L. Lytic cycle switches of oncogenic human gammaherpesviruses. Adv Cancer Res. 97, 81-109 (2007).
- Guito, J., Lukac, D. M. KSHV Rta Promoter Specification and Viral Reactivation. Front Microbiol. 3, 30 (2012).
